Análise de expressão gênica da via de sinalização do receptor do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 no câncer de endométrio

O câncer de endométrio tem incidência crescente, principalmente nos países desenvolvidos, devido ao estilo de vida moderno, aumento de casos de obesidade e diabetes, e diversos outros fatores que, em conjunto, estão tornando esta neoplasia na mais comum no trato reprodutor feminino. Ele é bastante influenciado pelo estado hormonal e por fatores reprodutivos das pacientes. Assim, é mais frequente no período pós-menopausa, quando pode ocorrer um desequilíbrio na sinalização do estrogênio. A diabetes e a obesidade são causadas, principalmente, pelo excesso de triglicerídeos e glicose circulantes, e pela resistência à insulina. A hiperglicemia leva à produção excessiva de insulina e do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1), sendo que estes hormônios são considerados antiapoptóticos e promotores da proliferação celular. Sabe-se que eles agem por vias semelhantes e que, provavelmente, o mecanismo responsável pela proliferação provocada por eles está associado à via PI3K/Akt/mTOR. Desta forma, avaliamos a expressão gênica de 92 genes na rota de sinalização do IGF1R em câncer de endométrio (n=3) e endométrio normal (n=2), através da técnica de qRT-PCR (ensaio TaqMan® Array Human IGF1R Signaling). Dentro destes genes, alguns estão envolvidos diretamente com a via PI3K/Akt/MAPK, outros estão implicados em processos como proliferação, diferenciação, tumorigênese, apoptose, resposta imune, síntese proteica, entre outros. Avaliamos, também, os níveis proteicos do receptor do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF1R), IGF1 e receptor da insulina (IR) pela técnica de imunohistoquímica, além da funcionalidade geral dos 4 genes mais diferencialmente expressos no câncer de endométrio Observamos que, dos 92 genes, 26 foram expressos somente no grupo câncer - CACNA1H, CRK, EIF2B5, ELK1, FRAP1 (MTOR), GYS1, HRAS, IGF2, IKBKB, IKBKE, ITPR3, KRAS, NFAT5, NFATC1, NFKB1, NFKBIB, NFKBIE, PIK3CA, PIK3CB, PLCB1, PLCB2, PLCG2, PRKCZ, RELB, SHC1 e YWHAZ; 46 tiveram expressão aumentada no grupo câncer de endométrio - AKT1, AKT2, ARAF, ATF4, BAD, BRAF, CACNA1C, CALM1, CALM2, CALM3, CREB1, EIF4E, FOXO3, GSK3B, IGF1, IGF1R, IKBKG, IRS1, MAP2K1, MAP2K2, MAPK3, MEF2C, MEF2D, NFATC2, NFATC3. NFKB2, NFKBIA, NRAS, PDPK1, PIK3CD, PIK3R1, PIK3R2, PLCG1, PPP3CA, PPP3R1, PRKCI, RAF1, RAPGEF1, RELA, RPS6, RPS6KB1, SOS1, YWHAB, YWHAE, YWHAH e YWHAQ, um não apresentou expressão em nenhum dos grupos (SLC2A4) e não foi possível analisar os restantes 20 genes, pois não foram expressos em todas as amostras. Quanto à expressão das proteínas IGF1R, IGF1 e IR, todas se mostraram mais expressas no câncer de endométrio e que se encontram localizadas principalmente no citoplasma das células. Assim, este trabalho mostra que a sinalização do IGF1R pode ter participação importante na aquisição do fenótipo maligno das células endometriais, e que o aumento das moléculas efetoras desta via no câncer de endométrio provavelmente está relacionado ao seu papel mitogênico.Endometrial cancer has a growing incidence, especially in developed countries, because of the modern lifestyle, increased cases of obesity and diabetes, and several other factors that together make this disease the most common in the female reproductive tract. Endometrial cancer is strongly influenced by the hormonal state and by the reproductive factors of the patients. Thus, it is attributed to the postmenopausal period, when estrogen signaling can be unbalanced, and consequently lead to malignant proliferative patterns. Diabetes and obesity are caused mainly by the excess of circulating triglycerides and glucose, and by insulin resistance. Hyperglycemia leads to excessive production of insulin and IGF1.These hormones are considered to have antiapoptotic effects and to promote cell proliferation. It is known that they are very similar pathways, and the mechanism responsible for this proliferation is associated with the PI3K/Akt/mTOR pathway. Thus, we evaluated the expression of 92 genes in IGF1R signaling pathway in endometrial cancer (n = 3) and normal endometrium (n = 2), using qRT-PCR (TaqMan® Array Human IGF1R Signaling test). Within these genes, some are in the PI3K/Akt/MAPK pathways, others are involved in proliferation, differentiation, tumorigenesis, apoptosis, immune response, protein synthesis, among others We also evaluated the protein levels of IGF1R, IGF1 and IR by immunohistochemistry, as well as the general functionality of the 4 most differentially expressed genes in endometrial cancer. We found that 26 genes were expressed only in endometrial cancer - CACNA1H, CRK, EIF2B5, ELK1, FRAP1 (mTOR), GYS1, HRAS, IGF2, IKBKB, IKBKE, ITPR3, KRAS, NFAT5, NFATc1, NFKB1, NFKBIB, NFKBIE, PIK3CA, PIK3CB, PLCB1, PLCB2, PLCG2, PRKCZ, RELB, SHC1 and YWHAZ; 46 had increased expression in endometrial cancer, when compared to control group - AKT1, AKT2, ARAF, ATF4, BAD, BRAF, CACNA1C, CALM1, CALM2, CALM3, CREB1, eIF4E, FOXO3, GSK3B, IGF1, IGF1R IKBKG, IRS1, MAP2K1, MAP2K2, MAPK3 , MEF2C, MEF2D, NFATC2, NFATC3. NFKB2, NFKBIA, PIK3R1, PIK3R2, PLCG1, PPP3CA, PPP3R1, PRKCI, RAF1, RAPGEF1, RELA, RPS6, RPS6KB1, SOS1, YWHAB, YWHAE, YWHAH and YWHAQ, one showed no expression in neither groups (SLC2A4) and the other 20 were not expressed in all samples, so we decided not to analyze them. As for the expression of IGF1R, IGF1 and IR proteins, all them showed increased expression in endometrial cancer and were localized in the citoplasm. Thus, this work shows that IGF1R signaling may play an important role in the acquisition of a malignant phenotype by endometrial cells, and that the increase of these effectors in endometrial cancer is related to its mitogenic effects

Cultura de tecido ovariano para preservação da fertilidade em pacientes transexuais masculinos após tratamento hormonal

Objective To evaluate the reproductive and histological characteristics of fresh cultured ovarian tissue from transgender male patients. Methods An in vitro pilot study in which samples were collected during sex reassignment surgery for transgender male patients. The ovarian cortex was cut into fragments of 2 mm, 3 mm, and 4 mm, and placed in a 96-well plate suitable for cultivation at days 0, 2, 4, 6, and 8, when the histology was analyzed. Results Stromal hyperplasia was observed in all samples, and it was not associated with the obtainment of primordial or primary follicles. Peripheral reduction in cell count was also a recurrent finding. Primordial and primary follicles were identified with a heterogeneous pattern in fragments from the same patient and from different patients, and follicles in more advanced stages of development (secondary and antral) were not found. There was an association between the diameter of the ovarian fragments and the identification of primary follicles (p = 0.036). The number of days in culture was associated with histological signs of tissue damaging in the fragments (p = 0.002). The total number of follicles identified in the samples with 2 mm in diameter was significantly lower than in those that measured 4 mm in diameter (p = 0.031). Conclusion A diameter of 4 mm is suitable for ovarian tissue culture with the benefit of ease of handling. Even after prolonged exposure to testosterone, the ovarian fragments presented primordial and primary follicles, maintaining viability throughout the days they were exposed to the culture. Freezing the ovarian cortex of transgender patients who will undergo surgery for gender reassignment would be an interesting option, in the future, for the preservation of fertility.Objetivo Avaliar as características reprodutivas e histológicas de tecido ovariano cultivado a fresco de pacientes transexuais masculinos. Métodos Estudo experimental in vitro e piloto, no qual amostras foram coletadas durante a cirurgia de redesignação de sexo para pacientes transexuais masculinos. O córtex ovariano foi cortado em fragmentos de 2 mm, 3 mm, e 4 mm, e colocado em placa de 96 poços própria para cultivo nos dias 0, 2, 4, 6 e 8, quando a histologia foi analisada. Resultados Hiperplasia estromal foi observada em todas as amostras, e não esteve associada à obtenção de folículos primordiais ou primários. A redução periférica no número de células também foi um achado recorrente. Folículos primordiais e primários foram identificados com padrão heterogêneo em fragmentos do mesmo paciente e em fragmentos de pacientes diferentes, não sendo encontrados folículos em estágios mais avançados de desenvolvimento (secundários e antrais). Houve associação entre o diâmetro dos fragmentos ovarianos e a identificação dos folículos primários (p = 0,036). O número de dias de cultura esteve associado a sinais histológicos de lesão tecidual nos fragmentos (p = 0,002). O número total de folículos identificados nas amostras de 2 mm de diâmetro foi significativamente menor do que nas de 4 mm de diâmetro (p = 0,031). Conclusão O diâmetro de 4 mm parece ser mais adequado para a cultura de tecido ovariano com a vantagem de fácil manejo. Mesmo após exposição prolongada à testosterona, os fragmentos ovarianos apresentavam folículos primordiais e primários, e manteve a viabilidade ao longo dos dias de exposição à cultura. No futuro, o congelamento da cortical do ovário de pacientes transgêneros que se submeterão à cirurgia de redesignação sexual poderia ser uma opção interessante para a preservação da fertilidade

Efeito da metformina no potencial metastático de células epiteliais endometriais primárias em um ambiente hiperinsulinêmico

O endométrio é a camada mucosa que reveste o útero internamente. Este tecido sofre alterações cíclicas em mulheres ainda na idade reprodutiva, decorrente da estimulação por hormônios. Os principais hormônios neste tecido são a progesterona e o estrogênio que modulam a proliferação e diferenciação das células endometriais, processos importantes na regeneração após o ciclo menstrual. O endométrio pode ser alvo de patologias como o câncer, endometriose e cistos, que afetam a sua função fisiológica. O câncer de endométrio tem se tornado cada vez mais prevalente devido ao estilo de vida moderno, aumento de casos de obesidade e consequentemente hiperglicemia e hiperinsulinemia. A faixa etária mais acometida com esta patologia são mulheres após os 50 anos, na menopausa. Neste período elas se tornam mais predispostas ao acúmulo de gordura abdominal e atrofia endometrial devido à ausência do hormônio estrogênio. Este estado se agrava com o desenvolvimento de metástases, que conferem agressividade à doença pela proliferação excessiva das células tumorais e invasividade. A hiperinsulinemia surge principalmente do aumento da resistência à insulina, que faz aumentar os níveis glicêmicos na circulação sanguínea. A hiperglicemia leva a uma superprodução de insulina no pâncreas, sendo que este hormônio é considerado um antiapoptótico e promotor da proliferação celular. O mecanismo provável da proliferação provocada pela insulina está envolvido com a via PI3K/Akt e mTOR diretamente e com a IGF-1 indiretamente. Sabe-se que a insulina e a IGF-1 agem por vias semelhantes. Estudos epidemiológicos mostraram uma associação entre altos níveis de insulina e diversos tipos de câncer, incluindo o câncer endometrial, sendo que mulheres acometidas com a diabetes apresentam alto risco de desenvolver neoplasias. Isto levou à proposta da utilização de agentes insulino-sensibilizantes no tratamento do câncer, sendo o fármaco metformina um dos melhores candidatos na classe. Os mecanismos pela qual a metformina atua ainda não são completamente esclarecidos. Desta forma, avaliamos o efeito da metformina no potencial metastático de células epiteliais endometriais primárias de pacientes saudáveis, quando na presença de excesso de insulina. Os parâmetros avaliados foram a habilidade de invasão, migração e proliferação destas células após um período de tratamento com a metformina. Para isso as células foram divididas nos grupos G1 (Controle), G2 (Insulina), G3 (Metformina) e G4 (Insulina+Metformina). Foi utilizado o Ensaio de Invasão e Ensaio de Migração para testar a capacidade de invadir e migrar (n=4). No primeiro ensaio, os resultados mostraram uma redução da taxa de migração do grupo G3 em relação aos grupos G1 e G4. A invasão das células tratadas com metformina (G3) também diminuiu quando comparada ao grupo G4, mas não ao Controle. Não se observou um aumento da migração e invasão no grupo tratado com insulina. Para avaliar à capacidade de proliferação foi realizado o Ensaio de Proliferação EdU (n=1) com as células tratadas por 24 horas. Os dados obtidos são demonstrativos e indicaram uma redução acentuada da densidade celular dos grupos G3 e G4 em relação ao grupo tratado com insulina após as 24 horas. No entanto as taxas de proliferação de todos os grupos nas 4 horas subsequentes ao tratamento foram significativamente maiores que o grupo Controle. Estes resultados sugerem que a metformina atua diminuindo a invasão, migração e proliferação das células endometriais primárias, sendo necessários mais estudos para confirmar e melhor elucidar os mecanismos envolvidos

Proliferation and metastatic potential of endometrial cancer cells in response to metformin treatment in a high versus normal glucose environment

In order to improve our understanding of the potential preventive and therapeutic role of metformin, the present study aimed to investigate the capability of low-dose metformin in the efficient inhibition of cancer development and the reduction of the metastasis of endometrial adenocarcinoma type I and primary endometrial epithelial cells (eEPs), with the drug acting as a treatment in a hyperinsulinemic environment exposed to high and normal glucose conditions. The Ishikawa endometrial adenocarcinoma cell line and primary eEPs were exposed to an environment with high (17 mM) or normal glucose (5 mM) and treated with insulin, low-dose metformin (0.1 mM) or a combined treatment. Metastatic potential was assessed by migration and invasion assays, and relative cell proliferation was determined. Metformin at a low dose potently inhibited the insulin action, decreasing the ability of the endometrial cancer (EC) cell line to migrate and invade in a high and normal glucose environment, and decreasing the migration ability of the primary eEPs. In the EC cell line, the insulin treatment increased the proliferation, without any subsequent reduction of proliferation by the addition of 0.1 mM metformin; however, relative cell proliferation sensitivity to metformin was observed in the range between 1 and 5 mM regardless of the glucose concentration present. Overall, metformin at 0.1 mM is not efficient enough to decrease the proliferation in an EC cell line. However, at this concentration, metformin can inhibit the insulin action in endometrial epithelial cancer cells, demonstrating an anti-metastatic effect in high and normal glucose environments