Insertional mutagenesis in Penicillium griseoroseum mediated by the transposable element impala of Fusarium oxysporum

O elemento transponível impala, isolado do fungo fitopatogênico Fusarium oxysporum, é capaz de sofrer transposição em Penicillium griseoroseum, porém, com uma baixa frequência. Em trabalho anterior, condições de estresse, testadas com o objetivo de aumentar a transposição de impala em P. griseoroseum, foram eficientes, sendo isoladas 691 colônias revertentes, em que o elemento impala havia sofrido transposição. Neste trabalho, foram feitas a caracterização molecular das linhagens revertentes e a avaliação da produção de enzimas pectinolíticas, com o objetivo de testar a eficiência de impala como ferramenta para a etiquetagem e isolamento de genes que codificam pectinases. As análises por hibridização das linhagens revertentes, utilizando como sonda o elemento impala e o gene niaD de A. nidulans, demonstraram que o tratamento por irradiação foi mais eficiente do que o choque térmico para a ativação da transposição em P. griseoroseum. Nas linhagens revertentes obtidas após a irradiação, um maior número de sítios de reinserção de impala foi observado. Entre as linhagens revertentes provenientes do choque térmico, uma apresentou perda total do elemento impala. Das 650 linhagens revertentes analisadas quanto à produção de pectinases, uma linhagem obtida após choque térmico apresentou atividade significativamente inferior de pectina liase quando comparada à linhagem selvagem. A região flanqueadora do novo sítio de inserção do elemento impala foi amplificada por PCR invertido. O fragmento amplificado de 600pb foi clonado e será utilizado como sonda para o isolamento do gene completo em um banco genômico da linhagem selvagem de P. griseoroseum. Este trabalho demonstra, pela primeira vez, que o elemento impala pode ser usado para a etiquetagem de genes no fungo Penicillium griseoroseum.The tranposable element impala, isolated from the phytopathogenic fungus Fusarium oxysporum, suffers transposition in Penicillium griseoroseum, albeit at low frequency. In a previous work, stress conditions tested to increase impala transposition in P. griseoroseum have been show to be very efficient, resulting in the production of 691 revertant colonies in which impala had suffered transposition. In this work, a molecular characterization of revertant colonies and the analysis of pectinolytic enzyme were done to test impala efficiency as a tool for tagging and isolating pectinase gene. Hybridization analysis of revertant colonies using impala and the niaD gene of Aspergillus nidulans as probes demonstrated that UV treatment was more efficient than thermal shock for the activation of impala transposition in P. griseoroseum. In the revertant colonies obtained after UV irradiation, a larger number of reinsertion sites was observed. Among the revertants produced by thermal shock, one strain showed total loss of impala. Among 650 revertant colonies analyzed for pectinase production, one isolate obtained after thermal shock treatment presented significantly lower pectin lyase activity than the wild type strain. The flanking region of the new insertion site of impala was amplified by inverted PCR. A 600-pb amplified fragment was cloned and will be used as probe for the isolation of the complete gene from a library of the type strain of P. griseoroseum. ixThis work demonstrates for the first time that the element impala can be used for efficient gene tagging in P. griseoroseum.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Regulation of the expression of the gene plg1 that code for pectin lyase in Penicillium griseoroseum

Penicillium griseoroseum tem se mostrado promissor para aplicação industrial considerando a produção de pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG). Quando P. griseoroseum é cultivado na presença de glicose, transcritos do gene plg1 são detectados em baixos níveis, evidenciando o efeito da repressão catabólica. No entanto na ausência do indutor natural, a pectina, e na presença de sacarose suplementado com extrato de levedura ou metilxantinas, os transcritos do gene plg1 são detectados. O gene plg2 é transcrito em níveis basais mesmo na presença de pectina, não sendo detectado nenhum produto de amplificação em condições de repressão catabólica. A linhagem mutante M03 de P. griseoroseum, que apresenta desrepressão catabólica, é mais resistente às condições de repressão catabólica impostas por altas concentrações de glicose no meio de cultivo, e conseqüentemente, maior produção de PL. Substâncias que afetam a cascata de transdução de sinais via cAMP, cafeína e NaF, agem de maneira sinérgica na produção de PL. Quando a linhagem mutante M03 de P. griseoroseum é cultivada em meios contendo estas substâncias, apresenta maior atividade de PL em comparação à linhagem selvagem. Uma maior capacidade de manutenção do nível endógeno de cAMP pela linhagem mutante M03 de P. griseoroseum em relação à linhagem selvagem pode ter sido o motivo da amplificação do sinal de transdução via cAMP, resultando em uma maior produção de PL. O processo de repressão catabólica está correlacionado com uma via de transdução de sinal dependente do cAMP. A determinação da funcionalidade dos cis-elementos presentes na região reguladora do gene plg1 foi investigada por meio de deleções, permitindo identificar um fragmento de 319 pb (Fragmento B), posicionado entre 506 e 187 em relação ao sítio +1 da tradução, como importante para a expressão do gene plg1 em condição de indução por pectina. A indução da expressão do gene plg1 por sacarose/extrato de levedura não depende dos mesmos cis-elementos envolvidos na indução por pectina. A funcionalidade de dois sítios de ligação consenso à proteína CreA, posicionados a 432 e 569, também foi determinada. Estudos com mutações pontuais no fragmento de 319 pb poderão evidenciar um sítio essencial para indução da expressão do gene plg1, que poderá ser empregado como alternativa na obtenção de uma linhagem superprodutora de PL para aplicação industrial, assim como para um possível sistema de expressão para produção de proteínas heterólogas em P. griseoroseum.Penicillium griseoroseum has been considered a promising species for industrial application because of its capacity to produce pectin lyase (PL) and polygalacturonase. When P. griseoroeum is grown in the presence of glucose, plg1 gene transcripts are detected at low levels, evidencing the effects of catabolic repression. However, in the absence of the natural inducer, pectin, and in the presence of sucrose supplemented with yeast extract and methylxanthines, plg1 transcripts are detected. The plg2 gene transcripts are detected at low levels in presence pectin, and it not being detected no product of amplification in conditions of catabolic repression The mutant strain M03 of P. griseoroseum is resistant to catabolic repression by high glucose concentrations in the culture medium, showing significant PL production. Substances that affect signal transduction pathways via cAMP, caffeine and NaF, act synergistically for PL production. When the mutant strain M03 is grown in media containing these substances, higher PL activities are observed in comparison to the wild type. Our results suggest that the differences in PL activity between the strains tested can be due to a cAMP-dependent signaling cascade and that the M03 produces a higher level of cAMP than the wild type, favoring the expression of the plg1 gene. The functional analysis of cis-elements located at the regulatory region of plg1 gene was investigated by the analyses of transformants containing different deletions in this region. This allowed the detection of a 319-bp fragment (b fragment), located at -506 and -187 upstream the +1 of transduction, important for the induction of plg1 in the presence of pectin. The plg1 induction by sucrose and yeast extract is not dependent of the same cis-elements involved in plg1 induction by pectin. The role of two CREA-binding cis-elements, located at -432 and -569, was also determined. Studies with point mutations in the b fragment may evidence essential sites for the induction of plg1. Such studies would allow advances towards the production of enzyme hiper-producing strains for industrial application and the expression of heterologous proteins in P. griseoroseum.Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerai

Diferenciação de sorotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae pela combinação de dois PCR multiplex Differentiation of Actinobacillus pleuropneumoniae serotypes by the combination of two multiplex PCR

A pleuropneumonia suína é uma importante doença respiratória que ocasiona grandes perdas econômicas na suinocultura. O Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) é o agente etiológico desta enfermidade que é classificado em 15 sorotipos. Estes secretam diferentes combinações das exotoxinas ApxI, ApxII, Apx III e ApxIV, que têm sido utilizadas na diferenciação dos sorotipos pela PCR multiplex (mPCR). A técnica descrita não permite a diferenciação dos sorotipos 2, 8 e 15 (apresentam mesmo padrão de amplificação) como também os sorotipos 12 e 13. Visando a melhorar a capacidade discriminatória desse procedimento, o presente trabalho descreve a combinação de um segundo mPCR baseado na amplificação de genes dos antígenos capsulares. O ensaio conjugado foi testado com cepas de referência pertencentes aos 15 sorotipos e também de 10 isolados de campo. A técnica proposta auxiliou na diferenciação dos 15 sorotipos testados (cepas de referência), como também proporcionou a identificação dos isolados de campo provenientes de casos clínicos, demonstrando que a técnica molecular é uma forma rápida e eficiente na identificação desse importante patógeno que afeta a criação de suínos, mesmo levando em consideração as limitações da técnica.The swine pleuropneumonia is a major respiratory disease that causes great economic losses in pig farming. The Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) is the etiologic agent of this disease and are classified into 15 serotypes. These secrete different combinations of exotoxins ApxI, ApxII, APX and ApxIV III have been used in the differentiation of serotypes by multiplex PCR (mPCR). The reported technique does not allow the differentiation of serotypes 2, 8 and 15 (exhibit same pattern of amplification) as well as serotypes 12 and 13. In order to improve the discriminatory capacity of this procedure, this paper describes the combination of a second mPCR based on amplification of genes of capsular antigens. The combined test was tested with reference strains belonging to 15 serotypes and also 10 field isolates. The proposed technique was capable of differentiating all 15 serotypes tested (reference strains), and was able to identify field isolates from clinical cases, demonstrating that the molecular technique is a quick and efficient identification of this important pathogen that affects the swine production. The proposed technique assisted in differentiating the 15 serotypes tested (reference strains), but also provided identification of field isolates from clinical cases, demonstrating that the molecular technique is a quick and efficient identification of this important pathogen that affects pig farming, even taking into account the limitations of the technique

The minimal regulatory region necessary for the expression of the Penicillium griseoroseum plg1 gene

The expression of the Penicillium griseoroseum plg1 gene is induced by citric pectin and repressed by glucose. In this work, the minimal region of the plg1 gene promoter essential for expression in pectin and sucrose plus yeast extract was identified by using constructs containing the gfp ORF under control of the plg1 gene promoter. The fragment A (283 bp) is essential for plg1 expression in sucrose plus yeast extract. Fragment B (309 bp plus 184; core promoter) was critical for expression in pectin and abolished the catabolic repression by glucose. Therefore, the fragment of 776 bp (fragment A and B) is essential for the expression of the plg1 gene in natural inducing conditions (pectin as carbon source) and in sucrose plus yeast extract. The fragment B is a promising minimal promoter usable for heterologous expression in filamentous fungi, since genes that contain it could be activated by the presence of peel from citric fruits (which contains citric pectin) and are not affected by glucose in these agricultural by-products