The Shigella OspC3 Effector Inhibits Caspase-4, Antagonizes Inflammatory Cell Death, and Promotes Epithelial Infection

SummaryCaspase-mediated inflammatory cell death acts as an intrinsic defense mechanism against infection. Bacterial pathogens deploy countermeasures against inflammatory cell death, but the mechanisms by which they do this remain largely unclear. In a screen for Shigella flexneri effectors that regulate cell death during infection, we discovered that Shigella infection induced acute inflammatory, caspase-4-dependent epithelial cell death, which is counteracted by the bacterial OspC3 effector. OspC3 interacts with the caspase-4-p19 subunit and inhibits its activation by preventing caspase-4-p19 and caspase-4-p10 heterodimerization by depositing the conserved OspC3 X1-Y-X2-D-X3 motif at the putative catalytic pocket of caspase-4. Infection of guinea pigs with a Shigella ospC3-deficient mutant resulted in enhanced inflammatory cell death and associated symptoms, correlating with decreased bacterial burdens. Salmonella Typhimurium and enteropathogenic Escherichia coli infection also induced caspase-4-dependent epithelial death. These findings highlight the importance of caspase-4-dependent innate immune responses and demonstrate that Shigella delivers a caspase-4-specific inhibitor to delay epithelial cell death and promote infection

Parental transfer of the antimicrobial protein LBP/BPI protects Biomphalaria glabrata eggs against oomycete infections

Copyright: © 2013 Baron et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: This work was funded by ANR (ANR-07-BLAN-0214 and ANR-12-EMMA-00O7-01), CNRS and INRA. PvW was financially supported by the BBSRC. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.Peer reviewedPublisher PD

Involvement of the Cytokine MIF in the Snail Host Immune Response to the Parasite Schistosoma mansoni

We have identified and characterized a Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) family member in the Lophotrochozoan invertebrate, Biomphalaria glabrata, the snail intermediate host of the human blood fluke Schistosoma mansoni. In mammals, MIF is a widely expressed pleiotropic cytokine with potent pro-inflammatory properties that controls cell functions such as gene expression, proliferation or apoptosis. Here we show that the MIF protein from B. glabrata (BgMIF) is expressed in circulating immune defense cells (hemocytes) of the snail as well as in the B. glabrata embryonic (Bge) cell line that has hemocyte-like features. Recombinant BgMIF (rBgMIF) induced cell proliferation and inhibited NO-dependent p53-mediated apoptosis in Bge cells. Moreover, knock-down of BgMIF expression in Bge cells interfered with the in vitro encapsulation of S. mansoni sporocysts. Furthermore, the in vivo knock-down of BgMIF prevented the changes in circulating hemocyte populations that occur in response to an infection by S. mansoni miracidia and led to a significant increase in the parasite burden of the snails. These results provide the first functional evidence that a MIF ortholog is involved in an invertebrate immune response towards a parasitic infection and highlight the importance of cytokines in invertebrate-parasite interactions

Specific versus Non-Specific Immune Responses in an Invertebrate Species Evidenced by a Comparative de novo Sequencing Study

Our present understanding of the functioning and evolutionary history of invertebrate innate immunity derives mostly from studies on a few model species belonging to ecdysozoa. In particular, the characterization of signaling pathways dedicated to specific responses towards fungi and Gram-positive or Gram-negative bacteria in Drosophila melanogaster challenged our original view of a non-specific immunity in invertebrates. However, much remains to be elucidated from lophotrochozoan species. To investigate the global specificity of the immune response in the fresh-water snail Biomphalaria glabrata, we used massive Illumina sequencing of 5′-end cDNAs to compare expression profiles after challenge by Gram-positive or Gram-negative bacteria or after a yeast challenge. 5′-end cDNA sequencing of the libraries yielded over 12 millions high quality reads. To link these short reads to expressed genes, we prepared a reference transcriptomic database through automatic assembly and annotation of the 758,510 redundant sequences (ESTs, mRNAs) of B. glabrata available in public databases. Computational analysis of Illumina reads followed by multivariate analyses allowed identification of 1685 candidate transcripts differentially expressed after an immune challenge, with a two fold ratio between transcripts showing a challenge-specific expression versus a lower or non-specific differential expression. Differential expression has been validated using quantitative PCR for a subset of randomly selected candidates. Predicted functions of annotated candidates (approx. 700 unisequences) belonged to a large extend to similar functional categories or protein types. This work significantly expands upon previous gene discovery and expression studies on B. glabrata and suggests that responses to various pathogens may involve similar immune processes or signaling pathways but different genes belonging to multigenic families. These results raise the question of the importance of gene duplication and acquisition of paralog functional diversity in the evolution of specific invertebrate immune responses

Big bang et akirine, deux protéines impliquées dans la réponse inflammatoire de Drosophila melanogaster

La flore commensale endogène présente dans l intestin de tous les métazoaires doit être préservée afin d assurer le maintien de l homéostasie intestinale. La réponse immunitaire innée est donc finement régulée dans l intestin afin de permettre l élimination des microorganismes pathogènes tout en tolérant cette flore endogène. Dans ce contexte, la première partie de mon projet de thèse a porté sur l étude de la protéine Big bBang (BBG) localisée au niveau de l épithélium intestinal chez la drosophile adulte. J ai démontré que les mouches mutantes pour le gène bbg présentent un défaut de structure des jonctions septées (qui assurent l étanchéité de l épithélium intestinal) ainsi qu une activation constitutive de la réponse immunitaire innée dans l intestin, et qu elles meurent précocement. L étiologie des maladies inflammatoires chroniques de l intestin chez les mammifères, comme la maladie de Crohn, suggère que l inflammation constitutive du tube digestif est liée à un défaut des jonctions épithéliales de l intestin et à une réaction anormale contre la flore endogène, l administration d antibiotiques permettant de réduire l intensité de la réponse inflammatoire. D une manière similaire, l élimination de la flore intestinale endogène par l administration d antibiotiques permet de prévenir l inflammation constitutive de l intestin chez les mouches mutantes pour le gène bbg et leur mort précoce. Mes résultats suggèrent ainsi que BBG est une nouvelle protéine impliquée dans le maintien de la tolérance immunitaire envers la flore commensale.La seconde partie de mon projet de thèse a porté sur l étude de l Akirine, une protéine nucléaire impliquée dans la régulation différentielle de l expression des gènes cibles des facteurs de transcription NF- kB au cours de la réponse inflammatoire chez les insectes et chez les mammifères. Chez la drosophile, l Akirine agit dans la voie IMD. Afin de comprendre les mécanismes d action de l Akirine, j ai identifié 115 de ses partenaires protéiques potentiels par le biais de deux cribles protéomiques. J ai testé l implication de 47 d entre eux dans la voie IMD in vitro, et ainsi mis en évidence 5 activateurs et 1 répresseur de cette voie. Les fonctions de ces 6 protéines suggèrent que l Akirine pourrait contrôler la transcription des gènes cibles des facteurs de transcription NF- B en participant au remodelage de la chromatine avec le complexe Brahma.The endogenous flora present in the gut of all metazoans has to be preserved in order to maintain gut homeostasis. The gut innate immune response is then tightly regulated in order to eliminate pathogenic microorganisms and allow tolerance to this flora. In this context, the first part of my PhD project consisted in the study of the Big bBang (BBG) protein localized at the level of the Drosophila gut epithelium. My results showed that bbg null mutant flies have altered septate junctions (that are responsible for the maintenance of gut epithelium integrity) as well as constitutive activation of the gut innate immune response, and die prematurely. The etiology of inflammatory bowel diseases in mammals, such as Crohn s disease, suggests that gut chronic inflammation is linked to defects in gut epithelial junctions and to inappropriate reactions against the commensal flora as antibiotic treatment reduces inflammation. Similarly, the elimination of gut commensal flora by treatment with antibiotics can prevent constitutive inflammation of the gut of bbg mutant flies and rescues their impaired lifespan. Collectively my results suggest that BBG is a novel protein implicated in the maintenance of immune tolerance towards the commensal flora.The second part of my PhD project consisted in the study of Akirin, a nuclear protein implicated in the differential regulation of NF- B target genes expression in insects and mammals. In Drosophila, Akirin is implicated in the IMD pathway. In order to understand the function of Akirin, I identified 115 of its potential partners by using two proteomic screens. I tested the implication of 47 of them in the IMD pathway in vitro, and showed that five are activators and one is a repressor of this pathway. The function of these six proteins suggests that Akirin could control NF- B target genes expression by participating in the Brahma chromatin-remodeling complex.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

IDENTIFICATION DE NOUVEAUX GENES INDUITS LORS DE LA REPONSE IMMUNITAIRE DE LA DROSOPHILE

POUR CARACTERISER DE NOUVEAUX GENES DE LA REPONSE IMMUNITAIRE DE LA DROSOPHILE, J'AI UTILISE UNE TECHNIQUE DE PCR DIFFERENTIELLE PERMETTANT D'ISOLER DES ARNM DONT LA SYNTHESE EST MODULEE APRES UN STIMULUS IMMUN. CE CRIBLE M'A PERMIS D'IDENTIFIER, OUTRE DES GENES CODANT DES PEPTIDES ANTIMICROBIENS DEJA REPERTORIES, DEUX GROUPES DE GENES CODANTS DE NOUVELLES PROTEASES A SERINES ET DES INHIBITEURS DE PROTEASE DE LA FAMILLE KUNITZ. J'AI MIS EN EVIDENCE, QUE L'EXPRESSION DE CES DIFFERENTS GENES EST AUGMENTEE EN CONTEXTE INFECTIEUX, QUE LEURS CINETIQUES D'INDUCTION SONT VARIABLES SUIVANT LE GENE CONSIDERE ET L'AGENT INDUCTEUR UTILISE ET QUE LEUR EXPRESSION EST ALTEREE CHEZ DES DROSOPHILES MUTANTES POUR LES VOIES DE SIGNALISATION DE L'IMMUNITE. L'ANALYSE A L'AIDE D'ANTICORPS DIRIGES CONTRE UNE DES PROTEASES A PERMIS DE MONTRER QUE LA PROTEINE EST PRODUITE PAR LES CELLULES DU CORPS GRAS (UN EQUIVALENT FONCTIONNEL DU FOIE DE MAMMIFERES QUI CONSTITUE LE PRINCIPAL TISSU IMMUNOCOMPETENT CHEZ LA DROSOPHILE) ET QU'ELLE APPARAIT DANS L'HEMOLYMPHE RAPIDEMENT APRES UN BLESSURE SEPTIQUE. PLUSIEURS ACTIVITES PROTEOLYTIQUES DE L'HEMOLYMPHE LIEES A DIFFERENTS MECANISMES DE DEFENSE (COAGULATION, MELANISATION, PRODUCTION DE MOLECULES SIGNALISANTES) SONT DECLENCHES RAPIDEMENT APRES UN STIMULUS IMMUNITAIRE CHEZ LA DROSOPHILE. LES GENES QUE J'AI IDENTIFIES SONT DE BONS CANDIDATS POUR PARTICIPER A CES CASCADES PROTEOLYTIQUES. AFIN DE CARACTERISER LEURS FONCTIONS, J'AI UTILISE DEUX APPROCHES GENETIQUES DIFFERENTES : UNE MUTAGENESE PAR REMOBILISATION D'UN ELEMENT TRANSPOSABLE ET LA GENERATION DE DROSOPHILES TRANSGENIQUES. UN ELEMENT P A ETE INSERE DANS LE GROUPE DE GENES CODANT LES INHIBITEURS DE PROTEASE AFIN DE PERTURBER LEUR EXPRESSION. J'AI ANALYSE DES LIGNEES TRANSGENIQUES SUREXPRIMANT UNE DES PROTEASES SOUS FORMES CONSTITUTIVEMENT ACTIVE, INACTIVE (ZYMOGENE) OU MUTEE AU NIVEAU DU SITE CATALYTIQUE. L'ANALYSE DE CES OUTILS GENETIQUES SE POURSUIT ACTUELLEMENT.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Serpines et protéases à sérine dans la réponse immunitaire de la drosophile

Les Arthropodes se défendent contre les agressions microbiennes par un ensemble de réactions très efficaces, comprenant l'activation de cascades protéolytiques aboutissant à la coagulation, à la mélanisation et à la synthèse de peptides antimicrobiens. Ces cascades protéolytiques font intervenir des protéases à sérine et sont régulées par des serpines, qui sont des inhibiteurs de protéases à sérine. L'équipe au sein de laquelle j'ai effectué ma thèse étudie le rôle de serpines et de protéases à sérine dans la réponse immunitaire de la drosophile.La première cascade protéolytique mise en évidence dans l'immunité de la drosophile mène à l'activation de la voie Toll, qui contrôle l'expression de nombreux gènes dont les peptides antimicrobiens. Spaetzle, le ligand du récepteur Toll, est présent sous la forme d'un précurseur dans l'hémolymphe des drosophiles. Son activation lors des infections par les bactéries à Gram positif et par les champignons requiert une maturation protéolytique. Cette coupure est contrôlée par la serpine Necrotic, dont l'absence se traduit par l'activation de Toll en absence d'infection et le développement d'un phénotype de nécrose et de létalité des adultes quelques jours après leur émergence.Nous avons réalisé un crible génétique suppresseur de ce phénotype et identifié la première protéase à sérine (Perséphone) impliquée dans l'activation immunitaire de Spaetzle. L'analyse des mutants perséphone a révélé que, de façon tout à fait surprenante, les bactéries à Gram positif et les champignons activent deux cascades protéolytiques distinctes aboutissant à la coupure de Spaetzle.La serpine Necrotic possède dans sa région N-terminale une extension atypique riche en glutamine. Nous avons pu montrer que cette extension est coupée au cours de l'activation de la voie Toll. L'analyse de cette coupure a révélé une complexité et une relation inattendues entre les cascades protéolytiques activées respectivement par les bactéries à Gram positif et par les champignons. Une autre cascade protéolytique activée au cours de la réponse immunitaire des insectes mène à la coupure et à l'activation de l'enzyme de la mélanisation : la Phénoloxydase (PO). Nous avons isolé les premiers mutants de la cascade protéolytique aboutissant à l'activation de cette enzyme chez la drosophile.La première mutation affecte une serpine (la Serpine27A). Les mutants pour cette serpine présentent une activation constitutive de la PO en absence de stimulus immun. L'étude de la Serpine27A a révélé que l'activation de la PO nécessite une synthèse protéique préalable et qu'elle est sous le contrôle de la voie Toll.La deuxième mutation affecte une protéase à sérine, PAE1 (Prophenoloxidase Activating Enzyme 1) Les mutants PAE1 ne présentent aucune activation de la PO lors d'une infection. Leur étude nous a permis de montrer que l'activation de l'enzyme dépend d'une cascade protéolytique, ce qui n'était que supposé auparavant.Arthropods defend themselves against microbial aggression with an efficient battery of reactions, including activation of proteolytic cascades leading to coagulation, melanization and the production of antimicrobial peptides. These proteolytic cascades use serine proteases and they are regulated by serine protease inhibitors, such as the serpins. During my thesis, I studied the role of serpins and proteases in the Drosophila immune response.first proteolytic cascade found to be involved in the Drosophila immune response leads to activation of the Toll pathway, which controls the expression of numerous genes including those for the antimicrobial peptides. Spaetzle, the Toll ligand, is present as a precursor in Drosophila haemolymph. This precursor is proteolytically cleaved during Gram-positive bacterial or fungal infections, under the control of the serpin, Necrotic. Absence of Necrotic leads to constitutive activation of the Toll pathway and the development of a phenotype consisting of necrosis and adult mortality a few days after emergence. During a genetic suppressor screen using the Necrotic phenotype, Persephone, the first serine protease to be directly implicated in the immune activation of Spaetzle, was identified. Unexpectedly, the analysis of psh mutants revealed that two distinct proteolytic cascades can trigger immune activation of Spaetzle, dependant on either Gram-positive bacterial or fungal infection. In its N-terminal region, the serpin Necrotic has an atypically glutamine-rich extension. I was able to show that this section is removed during activation of the Toll pathway. A further analysis of this event revealed an unexpected level of complexity in relation with the proteolytic cascades activated by infections of Gram-positive bacteria or fungi.Another proteolytic cascade stimulated during the insect immune response leads to cleavage and activation of phenoloxidase (PO), the central enzyme of melanization. I isolated the first mutants involved in the proteolytic cascade controlling activation of PO in Drosophila.The first of these mutants, which displays a constitutive activation of PO, affects the Serpin27A gene. The study of Serpin27A revealed that protein production under the control of the Toll pathway must be underway before PO can be activated. The second mutant identified was in the gene encoding the serine protease Prophenoloxidase Activating Enzyme 1 (PAE1). This mutant has lost the capacity to activate PO during infections. The work carried out on PAE1 mutants allowed me to demonstrate that activation of PO in Drosophila depends on a proteolytic cascade.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Etude des mécanismes régulateurs de la réponse immunitaire innée de Drosophila melanogaster

La défense des animaux contre les infections repose sur une réponse immunitaire innée, immédiate, complétée par une réponse adaptative chez les vertébrés. L activation des facteurs NF- B est le principal signe de la réponse immunitaire innée dans tout le règne animal. La plupart des éléments impliqués au niveau des voies d activations des facteurs NF- B sont hautement conservés depuis les insectes jusqu à l homme. Cette conservation évolutive ainsi qu un grand nombre d outils disponibles et en particulier la génétique font de la Drosophile un excellent modèle pour l analyse de la réponse immunitaire innée. Mon projet a consisté en la caractérisation des mécanismes régulant la réponse immunitaire innée chez Drosophila melanogaster. Pour cela ma thèse a été divisée en trois axes, traitant chacun un aspect différent de la réponse immunitaire innée. Nous avons tout d abord analysé les mécanismes moléculaires mis à l oeuvre dans la voie de transduction du signal de la voie Imd, similaire à celle en aval du récepteur au TNFa. A cette occasion un site de clivage entre les résidus 30 et 31 de la protéine Imd a été mis en évidence à la fois in vitro et in vivo. Le clivage d Imd en cette position permet la liaison de DIAP2 et la polyubiquitination de la protéine Imd pour activer en aval les autres composants de la voie puis in fine la transcription des PAM. Dans un second temps, nous avons montré que le mutant Methuselah, dont l espérance de vie est supérieure de 35% aux drosophiles sauvages, résiste beaucoup mieux aux infections que des mouches sauvages. Afin de mieux comprendre les raisons de cette résistance, nous avons analysé l influence de cette mutation sur l activation de la réponse immunitaire. De manière surprenante, nous avons observé un sauvetage de la mutation Imd. Il semblerait que celui ci soit dû au rétablissement de l expression des PAM après infection. Et pour finir, toujours dans le registre de la régulation de l immunité innée chez la drosophile, nous avons étudié le rôle des voies impliqués dans la biosynthèse des petits ARN non codant. Il a été établi que leur absence affecte la survie des Drosophiles infectées par voie naturelle, principalement au niveau de l intestin. C est la première fois que l on attribue une fonction à une classe de petits ARN non codant endogènes, dits endo-siARN.The innate immune system constitutes the first line of defence against pathogens and is preserved in many animal phyla. NF- B factor activation represents a hallmark of innate immune responses among the animal kingdom. Most of the components involved in the activation of NF- B are highly conserved between insects and vertebrates. Conservation and the number of genetic tools available make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent model to study innate immune responses. My project focused on the characterization of mechanisms that are implicated in regulating the innate immune response in Drosophila melanogaster. I divided my thesis manuscript into three parts: First, we analyzed the molecular mechanisms involved in the IMD signal transduction pathway. We showed both in vitro and in vivo, that the cleavage side of the Imd protein is between the amino acid residues 30 and 31. This cleavage allows the binding of DIAP2 and polyubiquitination of the Imd protein in order to activate other downstream components of the Imd pathway resulting in the transcription of antimicrobial peptides. Second, we showed that the mutant Methuselah is more resistant to infections with Gramnegative bacteria compared to wild type flies. To characterize this phenotype in more detail, we analyzed the influence of this mutation on the activation of the innate immune response. Interestingly, the methuselah null mutant was able to restore the functionality of the IMD pathway. Finally, we studied the role of small non-coding RNA upon bacterial infections. We showed that the absence of functional non-coding RNA pathway affects the survival of the fly upon bacterial feeding. To the best of our knowledge, we provide for the first time evidence that a class of small endogenous non-coding RNA or endo-siRNAs may have a role in fighting bacterial infections.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Expression and secretion of insect immune peptides in yeast.

Cellular and molecular aspects of insect immunit

Nouveaux composants de la réponse immunitaire innée chez la Drosophile

La réponse immunitaire de la Drosophile implique l activation des voies de signalisations Toll et IMD contrôlant l expression de gènes codant des peptides antimicrobiens. Ces deux voies présentent de fortes similarités avec les voies NF-kB régulant la réponse immunitaire innée chez les mammifères. Durant ma thèse, j ai étudié les mécanismes d activation de la voie Toll. Mon travail a mené à une nouvelle perception des mécanismes de reconnaissances impliquant la detection des activités microbiennes. J ai également participé à l identification de nouveaux composants des voies Toll et IMD. Grâce à un crible par ARNi, nous avons identifié un nouveau gène, Akirin dont la fonction dans les voies NF-kB est conservée de la Drosophile aux mammifères. Lors d un crible à l EMS nous avons identifié deux nouveaux mutants des voies Toll et IMD respectivement. Ce travail procure de nouveaux outils pour la compréhension de la réponse immunitaire innée chez la Drosophile et les mammifèresThe hallmark of Drosophila immune response is the activation of the Toll and IMD pathways, which control the expression of antimicrobial peptides genes. Both pathways share similarities with NF- B pathways involved in mammalian immunity. During my thesis, I performed an analysis of the mechanisms of Toll pathway activation. In addition to the classical microbial motifs sensing, my work points to the detection of the invaders through a sensor system monitoring microbial activities. In a second project, I participated to the identification of new components in the Toll and IMD pathways. During an RNAi screen, we identified a new gene, Akirin, whose function in NF- B activation is conserved in drosophila and mammals. By an EMS mutagenesis screen we isolated two new mutants involved in the Toll and IMD pathways respectively. Characterization of these mutants is underway. Both projects provided new tools or concepts for a better understanding of innate immunity in drosophila and mammals.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF