Cellular localization of the potassium channel Kir7.1 in guinea pig and human kidney

Cellular localization of the potassium channel Kir7.1 in guinea pig and human kidney.BackgroundK+ channels have important functions in the kidney, such as maintenance of the membrane potential, volume regulation, recirculation, and secretion of potassium ions. The aim of this study was to obtain more information on the localization and possible functional role of the inwardly rectifying K+ channel, Kir7.1.MethodsKir7.1 cDNA (1114 bp) was isolated from guinea pig kidney (gpKir7.1), and its tissue distribution was analyzed by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). In addition, a genomic DNA fragment (6153 bp) was isolated from a genomic library. cRNA was expressed in Xenopus laevis oocytes for functional studies. Immunohistochemistry and RT-PCR were used to localize Kir7.1 in guinea pig and human kidney.ResultsThe expression of gpKir7.1 in Xenopus laevis oocytes revealed inwardly rectifying K+ currents. The reversal potential was strongly dependent on the extracellular K+ concentration, shifting from -14 mV at 96 mmol/L K+ to -90 mV at 1 mmol/L K+. gpKir7.1 showed a low affinity for Ba2+. Significant expression of gpKir7.1 was found in brain, kidney, and lung, but not in heart, skeletal muscle, liver, or spleen. Immunocytochemical detection in guinea pig identified the gpKir7.1 protein in the basolateral membrane of epithelial cells of the proximal tubule. RT-PCR analysis identified strong gpKir7.1 expression in the proximal tubule and weak expression in glomeruli and thick ascending limb. In isolated human tubule fragments, RT-PCR showed expression in proximal tubule and thick ascending limb.ConclusionOur results suggest that Kir7.1 may contribute to basolateral K+ recycling in the proximal tubule and in the thick ascending limb

Hämoxygenase-2 reguliert die Öffnungswahrscheinlichkeit des Kaliumkanals TREK-1durch die Produktion von Kohlenstoffmonoxid

Der mechanosensitive K2P-Kanal TREK-1 wird durch eine Vielzahl von physikalischen und chemischen Stimuli, sowie durch eine Reihe von Interaktionspartnern reguliert. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Interaktion des TREK-1 Kanals mit dem Enzym Hämoxygenase 2 (HO-2), welches den stereospezifischen Abbau von Häm zu Biliverdin, Fe2+ und CO katalysiert, zu charakterisieren und die funktionellen Auswirkungen aufzuklären. Die Interaktion zwischen dem Enzym HO-2 und TREK-1 konnte durch Koimmunopräzipitation bestätigt werden. Untersuchungen im Hefe-Zwei-Hybrid System mit HO-2 Verkürzungsmutanten zeigten, dass der distale Carboxyterminus der HO-2 eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit dem TREK-1 Kanal spielt. Die funktionellen Auswirkungen der Interaktion wurden mittels Strommessungen in Xenopus Oozyten untersucht. Eine Koexpression von humaner HO-2 und TREK-1 führte zu einer signifikanten Erhöhung der Stromamplitude von TREK-1, während die Koexpression der katalytisch inaktiven Form des Enzyms HO-2H45N, die ebenfalls mit TREK-1 interagierte, keine signifikante Änderung der Stromamplitude im Kanal hervorrief. Die funktionelle Relevanz der katalytischen Aktivität der HO-2 wurde mit Hilfe von Aktivatoren und Inhibitoren untersucht. Zugabe von Hämin, einem Aktivator der HO-2, führte in Oozyten, die HO-2 konstitutiv exprimieren, zu einem signifikanten Anstieg des TREK-1 Stromes. Zusätzliche Koexpression der humanen HO-2 führte zu einer signifikant stärkeren Zunahme des TREK-1 Stromes. Applikation von Zinkprotoporphyrin (ZnPP), einem HO-2 Inhibitor, führte hingegen zu einer signifikanten Reduktion der TREK-1 Stromamplitude. Applikation von CO mit Hilfe des CO-freisetzenden Moleküls CORM-2 führte zu einer Aktivierung des TREK-1 Kanals in Xenopus Oozyten und HEK293 Zellen. Messungen mit PhotoCORM-S1 und CO-Gas zeigten ebenfalls eine signifikante Aktivierung des TREK-1 Kanals. Auch die mechanosensitiven K2P-Kanäle TREK-2 und TRAAK konnten in ähnlichem Ausmaß wie TREK-1 durch CO aktiviert werden. CO ist ein wichtiges zelluläres Signalmolekül, interagiert mit einer Vielzahl von Proteinen und kann eine Reihe von Signalwegen modulieren. Meine Untersuchungen zu möglichen CO-abhängigen Signalwegen zeigten, dass die verschiedenen Phosphorylierungsstellen S362 (PKG-abhängige Phosphorylierungsstelle) und S344 (PKA-abhängige Phosphorylierungsstelle) im Carboxyterminus des TREK-1 Kanals nicht an der CO-vermittelten Aktivierung beteiligt sind. Eine Deletion des zytosolisch lokalisierten TREK-1 Aminoterminus bzw. Carboxyterminus zeigte darüber hinaus, dass die verkürzten Kanalvarianten weiterhin durch CO aktiviert werden konnten. Die Aktivierung des TREK-1 Stromes durch das gasförmige Signalmolekül NO war bei der carboxyterminalen Verkürzungsvariante allerdings nicht mehr möglich. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die gasförmigen Signalmoleküle CO und NO die Öffnungswahrscheinlichkeit von TREK-1 durch unterschiedliche Mechanismen beeinflussen. Eine direkte Wirkung von CO auf TREK-1 konnte durch inside-out Messungen in Giant-Patches von Xenopus Oozyten nachgewiesen werden. Meine Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass HO-2 an TREK-1 Kanäle bindet und durch lokale Produktion von CO die Öffungswahrscheinlichkeit des Kanals reguliert

Untersuchungen zur Interaktion zwischen dem Kaliumkanal TREK-1 und Hämoxygenasen

Einleitung Der mechanosensitive K2P-Kanal TREK-1 ist stark in neuronalem Gewebe exprimiert und wird durch verschiedene chemische und physikalische Stimuli und einige Interaktionspartner reguliert. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass TREK-1 an pathophysiologischen Prozessen wie Neuroprotektion, Schmerz und Depression beteiligt ist. TREK-1-Kanäle können das Ruhemembranpotential von Neuronen stabilisieren und spielen damit eine wichtige Rolle bei der Regulation der Membranerregbarkeit. Ziel dieser Arbeit war es, die direkte Interaktion der induzierbaren HO-1 und der konstitutiv exprimierten HO-2 mit TREK-1 zu vergleichen und Aminosäureregionen zu identifizieren, die für die Interaktion wichtig sind. Material und Methoden Um die direkte Interaktion von TREK-1 mit HO-1 und HO-2 zu testen, wurde das Split-Ubiquitin Hefe Zwei-Hybrid-System zur Untersuchung von Membran-proteinen verwendet. Dieses System nutzt die funktionelle Zusammenlagerung der beiden separierbaren Domänen des Ubiquitins, um Proteininteraktionen zu untersuchen. Die C-terminale Hälfte des Ubiquitins (Cub), an das ein artifizieller Transkriptionsfaktorkomplex gebunden ist, wurde an TREK-1 (Bait) fusioniert und die N-terminale Hälfte des Ubiquitins (NubG) wurde an HO-1 und HO-2 (Prey) fusioniert. Die Interaktion zwischen den Bait und Prey Proteinen bringt beide Ubiquitinhälften Cub und NubG zusammen, wodurch der Transkriptionsfaktorkomplex freigesetzt wird, in den Zellkern transloziert und dort die Expression von Reportergenen aktiviert. Die Hefezellen sind dann befähigt auf einem histidinfreien Selektionsmedium zu wachsen und beim -Galaktosidase-Assay eine Blaufärbung zu ergeben. Um die physiologische Relevanz der Interaktion von TREK-1 mit HO-1 und HO-2 zu untersuchen, wurden das Kanalprotein und die beiden Hämoxy-genasen in Xenopus laevis Oozyten coexprimiert und die TREK-1-Ströme mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme gemessen. Zur Herstellung von TREK-1-Konstrukten, die spezifische antigene Epitope enthalten, wurden das HA-Epitop (N-terminal) und das EGFP (C-terminal) mit Material and Methods To characterize the direct interaction of TREK-1 with HO-1 und HO-2, the split-ubiquitin yeast two-hybrid system was used, which is specialized for membrane proteins. This method utilizes complementation between separable domains of ubiquitin to study protein interactions. The C-terminal half of ubiquitin (Cub), along with an artificial transcription factor complex was fused to TREK-1 (bait) and the N-terminal half of ubiquitin (NubG) was fused to HO-1 or HO-2 (preys). Interaction between bait and prey proteins brings Cub and NubG together which activates the transcription factor complex. This complex enters the nucleus and activates the expression of several reporter genes which in turn enable the yeast cells to grow on a selective medium lacking histidine and turn blue in a -galactosidase assay. To investigate the physiological relevance of the interaction of TREK-1 with HO-1 and HO-2 the channel and the two heme oxygenase isoforms were co-expressed in Xenopus laevis oocytes and the TREK-1 currents were measured with the two-electrode voltage-clamp method. In order to produce TREK-1 constructs with specific antigenic epitopes the HA-epitope (N-terminally) and the EGFP (C-terminally) were fused to the TREK-

Comparison of cloned Kir2 channels with native inward rectifier K+ channels from guinea-pig cardiomyocytes

The aim of the study was to compare the properties of cloned Kir2 channels with the properties of native rectifier channels in guinea-pig (gp) cardiac muscle. The cDNAs of gpKir2.1, gpKir2.2, gpKir2.3 and gpKir2.4 were obtained by screening a cDNA library from guinea-pig cardiac ventricle.A partial genomic structure of all gpKir2 genes was deduced by comparison of the cDNAs with the nucleotide sequences derived from a guinea-pig genomic library.The cell-specific expression of Kir2 channel subunits was studied in isolated cardiomyocytes using a multi-cell RT-PCR approach. It was found that gpKir2.1, gpKir2.2 and gpKir2.3, but not gpKir2.4, are expressed in cardiomyocytes.Immunocytochemical analysis with polyclonal antibodies showed that expression of Kir2.4 is restricted to neuronal cells in the heart.After transfection in human embryonic kidney cells (HEK293) the mean single-channel conductance with symmetrical K+ was found to be 30.6 pS for gpKir2.1, 40.0 pS for gpKir2.2 and 14.2 pS for Kir2.3.Cell-attached measurements in isolated guinea-pig cardiomyocytes (n = 351) revealed three populations of inwardly rectifying K+ channels with mean conductances of 34.0, 23.8 and 10.7 pS.Expression of the gpKir2 subunits in Xenopus oocytes showed inwardly rectifying currents. The Ba2+ concentrations required for half-maximum block at -100 mV were 3.24 μm for gpKir2.1, 0.51 μm for gpKir2.2, 10.26 μm for gpKir2.3 and 235 μm for gpKir2.4.Ba2+ block of inward rectifier channels of cardiomyocytes was studied in cell-attached recordings. The concentration and voltage dependence of Ba2+ block of the large-conductance inward rectifier channels was virtually identical to that of gpKir2.2 expressed in Xenopus oocytes.Our results suggest that the large-conductance inward rectifier channels found in guinea-pig cardiomyocytes (34.0 pS) correspond to gpKir2.2. The intermediate-conductance (23.8 pS) and low-conductance (10.7 pS) channels described here may correspond to gpKir2.1 and gpKir2.3, respectively

Interaction with 14-3-3 proteins promotes functional expression of the potassium channels TASK-1 and TASK-3

The two-pore-domain potassium channels TASK-1, TASK-3 and TASK-5 possess a conserved C-terminal motif of five amino acids. Truncation of the C-terminus of TASK-1 strongly reduced the currents measured after heterologous expression in Xenopus oocytes or HEK293 cells and decreased surface membrane expression of GFP-tagged channel proteins. Two-hybrid analysis showed that the C-terminal domain of TASK-1, TASK-3 and TASK-5, but not TASK-4, interacts with isoforms of the adapter protein 14-3-3. A pentapeptide motif at the extreme C-terminus of TASK-1, RRx(S/T)x, was found to be sufficient for weak but significant interaction with 14-3-3, whereas the last 40 amino acids of TASK-1 were required for strong binding. Deletion of a single amino acid at the C-terminal end of TASK-1 or TASK-3 abolished binding of 14-3-3 and strongly reduced the macroscopic currents observed in Xenopus oocytes. TASK-1 mutants that failed to interact with 14-3-3 isoforms (V411*, S410A, S410D) also produced only very weak macroscopic currents. In contrast, the mutant TASK-1 S409A, which interacts with 14-3-3-like wild-type channels, displayed normal macroscopic currents. Co-injection of 14-3-3ζ cRNA increased TASK-1 current in Xenopus oocytes by about 70 %. After co-transfection in HEK293 cells, TASK-1 and 14-3-3ζ (but not TASK-1ΔC5 and 14-3-3ζ) could be co-immunoprecipitated. Furthermore, TASK-1 and 14-3-3 could be co-immunoprecipitated in synaptic membrane extracts and postsynaptic density membranes. Our findings suggest that interaction of 14-3-3 with TASK-1 or TASK-3 may promote the trafficking of the channels to the surface membrane

RNA editing modulates the binding of drugs and highly unsaturated fatty acids to the open pore of Kv potassium channels

The time course of inactivation of voltage-activated potassium (Kv) channels is an important determinant of the firing rate of neurons. In many Kv channels highly unsaturated lipids as arachidonic acid, docosahexaenoic acid and anandamide can induce fast inactivation. We found that these lipids interact with hydrophobic residues lining the inner cavity of the pore. We analysed the effects of these lipids on Kv1.1 current kinetics and their competition with intracellular tetraethylammonium and Kvβ subunits. Our data suggest that inactivation most likely represents occlusion of the permeation pathway, similar to drugs that produce ‘open-channel block'. Open-channel block by drugs and lipids was strongly reduced in Kv1.1 channels whose amino acid sequence was altered by RNA editing in the pore cavity, and in Kv1.x heteromeric channels containing edited Kv1.1 subunits. We show that differential editing of Kv1.1 channels in different regions of the brain can profoundly alter the pharmacology of Kv1.x channels. Our findings provide a mechanistic understanding of lipid-induced inactivation and establish RNA editing as a mechanism to induce drug and lipid resistance in Kv channels

A Specific Two-pore Domain Potassium Channel Blocker Defines the Structure of the TASK-1 Open Pore*

Two-pore domain potassium (K2P) channels play a key role in setting the membrane potential of excitable cells. Despite their role as putative targets for drugs and general anesthetics, little is known about the structure and the drug binding site of K2P channels. We describe A1899 as a potent and highly selective blocker of the K2P channel TASK-1. As A1899 acts as an open-channel blocker and binds to residues forming the wall of the central cavity, the drug was used to further our understanding of the channel pore. Using alanine mutagenesis screens, we have identified residues in both pore loops, the M2 and M4 segments, and the halothane response element to form the drug binding site of TASK-1. Our experimental data were used to validate a K2P open-pore homology model of TASK-1, providing structural insights for future rational design of drugs targeting K2P channels