Caracterização e otimização de cultivo dos fungos Bjerkandera adusta, Rhizoctonia sp. e Suillus sp., estudo químico e avaliação das atividades biológicas de extratos de Bjerkandera adusta

Orientadora : Profª. Drª. Marilis Dallarmi MiguelCoorientadores : Prof. Dr. Celso Garcia Auer, Drª Beatriz Cristina Konopatzki HirotaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 21/02/2017Inclui referências : f. 146-159Área de concentração: Insumos, medicamentos e correlatosResumo: Os fungos Bjerkandera adusta, Rhizoctonia sp. e Suillus sp. são fungos encontrados associados a plantas do gênero Pinus. O presente estudo tem como objetivo fornecer informações quanto as melhores condições de cultivo para esses fungos, além da abordagem química, análises físico-químicas e a investigação das atividades biológicas de Bjerkandera adusta. As colônias puras foram cultivadas em meio líquido visando maior produção de massa fúngica, variando-se os parâmetros: temperatura, meio de cultivo e tempo de incubação. Observou-se que a produção de massa micelial foi afetada por esses parâmetros, sendo maior quando empregadas as seguintes condições: 24 °C, meio BD ou extrato de malte, 28 a 35 dias de incubação para Bjerkandera adusta; 16 °C, meio BD ou extrato de malte, e 21 a 35 dias de incubação para Rhizoctonia sp.; e 16 a 20 °C, meio extrato de malte e 28 dias de incubação para Suillus sp. A massa fúngica e o caldo fermentado de B. adusta proveniente desses ensaios foram utilizados no preparo de extratos, analisados por Cromatografia de Camada Delgada (CCD) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), foram positivos para flavonoides e esteroides/triterpenos em CCD e variaram entre si em sua composição química. Cristais foram isolados da massa fúngica de B. adusta a 12°C, identificados por cristalografia como sendo o dissacarídeo ?,?-trehalose dihidratada. Posteriormente, realizou-se a produção da biomassa do fungo B. adusta. Foram realizadas as análises físico-químicas, como resultados obteve-se: 7,97% de umidade, 3,27% de cinzas, 9,32% de proteínas, 1,36% de lipídeos, 63,45% de carboidratos, 5,31% de fibras, 3,33% de quitina e pH de 4,99. O restante foi submetido a extração em Soxhlet, obtendo-se os extratos hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanólico. Esses extratos, além do extrato do caldo fermentado, foram utilizados nos ensaios de atividade biológica: avaliação do potencial tóxico frente à Artemia salina; atividade hemolítica; teor de compostos fenólicos totais; avaliação da atividade antioxidante pelos métodos de DPPH e Fosfomolibdênio; e avaliação da atividade antimicrobiana pela metodologia da concentração inibitória mínima (CIM). O extrato hexano foi tóxico para Artemia salina. Esse extrato exibiu toxicidade sobre as hemácias em placa de ágar sangue. Os extratos hexano e clorofórmio apresentaram atividade hemolítica. Os extratos clorofórmio, acetato de etila do micélio e do meio, e metanólico apresentaram alto teor de fenóis. Os extratos acetato de etila, da massa micelial e do caldo fermentado, e metanólico apresentaram atividade antioxidante pelo método do DPPH. O extrato acetato de etila do micélio apresentou maior atividade antioxidante pelo método do Fosfomolibdênio. Os extratos apresentaram baixa atividade antimicrobiana. Palavras-chave: Bjerkandera adusta; Rhizoctonia sp.; Suillus sp.; Pinus sp.; cultivo; atividades biológicas; análise química.Abstract: The fungi Bjerkandera adusta, Rhizoctonia sp. and Suillus sp. are fungi found associated with plants of the genus Pinus. The present study aims to provide information about the best cultivation conditions for these fungi, as well as the chemical approach, physicochemical analyzes and the investigation of the biological activities of Bjerkandera adusta. The pure colonies were cultivated in liquid medium aiming at higher production of fungal mass, varying the parameters: temperature, culture medium and incubation time. It was observed that the production of mycelial mass was affected by these parameters, being higher when the following conditions were used: 24 °C, BD or malt extract medium, 28 to 35 days of incubation for Bjerkandera adusta; 16 °C, BD or malt extract medium, and 21 to 35 days of incubation for Rhizoctonia sp .; And 16 to 20 °C, malt extract medium and 28 days of incubation for Suillus sp. The fungal mass and fermented broth of B. adusta from these tests were used in the preparation of extracts, analyzed by thin layer chromatography (CCD) and high performance liquid chromatography (HPLC), they were positive for flavonoids and steroids/triterpenes in CCD and varied among themselves in their chemical composition. Crystals were isolated from the fungal mass of B. adusta at 12 ° C, identified by crystallography as being disaccharide ?, ?-trehalose dihydrate. Subsequently, the biomass of the fungus B. adusta was carried out. The physico-chemical analyzes were performed, as results were obtained: 7.97% moisture, 3.27% ash, 9.32% protein, 1.36% lipids, 63.45% carbohydrates, 5.31% fibers, 3.33% chitin and pH of 4.99. The remainder was subjected to Soxhlet extraction, extracting hexane, chloroform, ethyl acetate and methanol extracts. These extracts, in addition to the extract of the fermented broth, were used in the biological activity tests: evaluation of the toxic potential against Artemia salina; hemolytic activity; content of total phenolic compounds; evaluation of antioxidant activity by DPPH and Phosphomolybdenum methods; and evaluation of the antimicrobial activity by the minimum inhibitory concentration methodology (MIC). The hexane extract was toxic to Artemia salina. This extract showed toxicity on the red blood agar plate. The extracts hexane and chloroform showed hemolytic activity. The chloroform, ethyl acetate, of the mycelium and of the medium, and methanolic extracts, presented high phenol content. The ethyl acetate, mycelial mass and fermented broth, and methanolic extracts presented antioxidant activity by the DPPH method. The ethyl acetate extract of the mycelium presented higher antioxidant activity by the Phosphomolybdenum method. The extracts presented low antimicrobial activity. Keywords: Bjerkandera adusta; Rhizoctonia sp.; Suillus sp.; Pinus sp.; cultivation; biological activities; physicochemical analysis; chemical analysis

Phytochemical and morpho-anatomical study of the vegetative organs of Psychotria fractistipula L.B.Sm., R.M. Klein & Delprete (Rubiaceae)

Psychotria fractistipula L.B.Sm, R.M. Klein & Delprete (Rubiaceae) is found in the existing Atlantic Forest in the South of Brazil, in the Paraná and Santa Catarina States. The members of Rubiaceae are characterized chemically by the presence of alkaloids, some pharmacological properties of which include antifungal, antibacterial, analgesic, antioxidant, antimutagenic, and antiviral activities. In this study, we report the results of anatomical, morphological, and histochemical analyses of the leaves and stems of the Rubiaceae family member, P. fractistipula. The anatomical analysis involved of light microscopy and scanning electron microscopy. Morpho-anatomical and histochemical characterization were made using standard methodology. The isolated compounds were identified by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopic analysis. The following structures are highlighted as the distinctive features of the species: presence of petiolate leaves and a petiole base, leaf blade with smooth cuticle on both surfaces, paracytic stomata, and, dorsiventral mesophyll and presence of trichomes on the leaves and stems. Phytosteroids, identified as β-sitosterol and campesterol, were observed in the hexane fraction of the stem. Future studies should focus on the isolation of other fractions of interest and their characterization through specific biological and cytotoxicity assays

Caracterização e otimização de cultivo dos fungos Bjerkandera adusta, Rhizoctonia sp. e Suillus sp., estudo químico e avaliação das atividades biológicas de extratos de Bjerkandera adusta

Orientadora : Profª. Drª. Marilis Dallarmi MiguelCoorientadores : Prof. Dr. Celso Garcia Auer, Drª Beatriz Cristina Konopatzki HirotaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 21/02/2017Inclui referências : f. 146-159Área de concentração: Insumos, medicamentos e correlatosResumo: Os fungos Bjerkandera adusta, Rhizoctonia sp. e Suillus sp. são fungos encontrados associados a plantas do gênero Pinus. O presente estudo tem como objetivo fornecer informações quanto as melhores condições de cultivo para esses fungos, além da abordagem química, análises físico-químicas e a investigação das atividades biológicas de Bjerkandera adusta. As colônias puras foram cultivadas em meio líquido visando maior produção de massa fúngica, variando-se os parâmetros: temperatura, meio de cultivo e tempo de incubação. Observou-se que a produção de massa micelial foi afetada por esses parâmetros, sendo maior quando empregadas as seguintes condições: 24 °C, meio BD ou extrato de malte, 28 a 35 dias de incubação para Bjerkandera adusta; 16 °C, meio BD ou extrato de malte, e 21 a 35 dias de incubação para Rhizoctonia sp.; e 16 a 20 °C, meio extrato de malte e 28 dias de incubação para Suillus sp. A massa fúngica e o caldo fermentado de B. adusta proveniente desses ensaios foram utilizados no preparo de extratos, analisados por Cromatografia de Camada Delgada (CCD) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), foram positivos para flavonoides e esteroides/triterpenos em CCD e variaram entre si em sua composição química. Cristais foram isolados da massa fúngica de B. adusta a 12°C, identificados por cristalografia como sendo o dissacarídeo ?,?-trehalose dihidratada. Posteriormente, realizou-se a produção da biomassa do fungo B. adusta. Foram realizadas as análises físico-químicas, como resultados obteve-se: 7,97% de umidade, 3,27% de cinzas, 9,32% de proteínas, 1,36% de lipídeos, 63,45% de carboidratos, 5,31% de fibras, 3,33% de quitina e pH de 4,99. O restante foi submetido a extração em Soxhlet, obtendo-se os extratos hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanólico. Esses extratos, além do extrato do caldo fermentado, foram utilizados nos ensaios de atividade biológica: avaliação do potencial tóxico frente à Artemia salina; atividade hemolítica; teor de compostos fenólicos totais; avaliação da atividade antioxidante pelos métodos de DPPH e Fosfomolibdênio; e avaliação da atividade antimicrobiana pela metodologia da concentração inibitória mínima (CIM). O extrato hexano foi tóxico para Artemia salina. Esse extrato exibiu toxicidade sobre as hemácias em placa de ágar sangue. Os extratos hexano e clorofórmio apresentaram atividade hemolítica. Os extratos clorofórmio, acetato de etila do micélio e do meio, e metanólico apresentaram alto teor de fenóis. Os extratos acetato de etila, da massa micelial e do caldo fermentado, e metanólico apresentaram atividade antioxidante pelo método do DPPH. O extrato acetato de etila do micélio apresentou maior atividade antioxidante pelo método do Fosfomolibdênio. Os extratos apresentaram baixa atividade antimicrobiana. Palavras-chave: Bjerkandera adusta; Rhizoctonia sp.; Suillus sp.; Pinus sp.; cultivo; atividades biológicas; análise química.Abstract: The fungi Bjerkandera adusta, Rhizoctonia sp. and Suillus sp. are fungi found associated with plants of the genus Pinus. The present study aims to provide information about the best cultivation conditions for these fungi, as well as the chemical approach, physicochemical analyzes and the investigation of the biological activities of Bjerkandera adusta. The pure colonies were cultivated in liquid medium aiming at higher production of fungal mass, varying the parameters: temperature, culture medium and incubation time. It was observed that the production of mycelial mass was affected by these parameters, being higher when the following conditions were used: 24 °C, BD or malt extract medium, 28 to 35 days of incubation for Bjerkandera adusta; 16 °C, BD or malt extract medium, and 21 to 35 days of incubation for Rhizoctonia sp .; And 16 to 20 °C, malt extract medium and 28 days of incubation for Suillus sp. The fungal mass and fermented broth of B. adusta from these tests were used in the preparation of extracts, analyzed by thin layer chromatography (CCD) and high performance liquid chromatography (HPLC), they were positive for flavonoids and steroids/triterpenes in CCD and varied among themselves in their chemical composition. Crystals were isolated from the fungal mass of B. adusta at 12 ° C, identified by crystallography as being disaccharide ?, ?-trehalose dihydrate. Subsequently, the biomass of the fungus B. adusta was carried out. The physico-chemical analyzes were performed, as results were obtained: 7.97% moisture, 3.27% ash, 9.32% protein, 1.36% lipids, 63.45% carbohydrates, 5.31% fibers, 3.33% chitin and pH of 4.99. The remainder was subjected to Soxhlet extraction, extracting hexane, chloroform, ethyl acetate and methanol extracts. These extracts, in addition to the extract of the fermented broth, were used in the biological activity tests: evaluation of the toxic potential against Artemia salina; hemolytic activity; content of total phenolic compounds; evaluation of antioxidant activity by DPPH and Phosphomolybdenum methods; and evaluation of the antimicrobial activity by the minimum inhibitory concentration methodology (MIC). The hexane extract was toxic to Artemia salina. This extract showed toxicity on the red blood agar plate. The extracts hexane and chloroform showed hemolytic activity. The chloroform, ethyl acetate, of the mycelium and of the medium, and methanolic extracts, presented high phenol content. The ethyl acetate, mycelial mass and fermented broth, and methanolic extracts presented antioxidant activity by the DPPH method. The ethyl acetate extract of the mycelium presented higher antioxidant activity by the Phosphomolybdenum method. The extracts presented low antimicrobial activity. Keywords: Bjerkandera adusta; Rhizoctonia sp.; Suillus sp.; Pinus sp.; cultivation; biological activities; physicochemical analysis; chemical analysis