Amino Acids Stimulate TORC1 through Lst4-Lst7, a GTPase-Activating Protein Complex for the Rag Family GTPase Gtr2

Rag GTPases assemble into heterodimeric complexes consisting of RagA or RagB and RagC or RagD in higher eukaryotes, or Gtr1 and Gtr2 in yeast, to relay amino acid signals toward the growth-regulating target of rapamycin complex 1 (TORC1). The TORC1-stimulating state of Rag GTPase heterodimers, containing GTP- and GDP-loaded RagA/B/Gtr1 and RagC/D/Gtr2, respectively, is maintained in part by the FNIP-Folliculin RagC/D GAP complex in mammalian cells. Here, we report the existence of a similar Lst4-Lst7 complex in yeast that functions as a GAP for Gtr2 and that clusters at the vacuolar membrane in amino acid-starved cells. Refeeding of amino acids, such as glutamine, stimulated the Lst4-Lst7 complex to transiently bind and act on Gtr2, thereby entailing TORC1 activation and Lst4-Lst7 dispersal from the vacuolar membrane. Given the remarkable functional conservation of the RagC/D/Gtr2 GAP complexes, our findings could be relevant for understanding the glutamine addiction of mTORC1-dependent cancers

Feedback inhibition of the Rag GTPase GAP complex Lst4-Lst7 safeguards TORC1 from hyperactivation by amino acid signals

Amino acids stimulate the eukaryotic target of rapamycin complex 1 (TORC1), and hence growth, through the Rag GTPases and their regulators. Among these, the yeast Lst4-Lst7 Rag GTPase GAP complex clusters, as we previously reported, at the vacuolar membrane upon amino acid starvation. In response to amino acid refeeding, it activates the Rag GTPase-TORC1 branch and is then dispersed from the vacuolar surface. Here, we show that the latter effect is driven by TORC1 itself, which directly phosphorylates several residues within the intra-DENN loop of Lst4 that, only in its non-phosphorylated state, tethers the Lst4-Lst7 complex to the vacuolar membrane. An Lst4 variant disrupting this feedback inhibition mechanism causes TORC1 hyperactivation and proliferation defects in cells grown on poor nitrogen sources. Thus, we identify Lst4 as a TORC1 target and key node of a homeostatic mechanism that adjusts TORC1 activity to the availability of amino acids

Multilayered control of protein turnover by torc1 and atg1

The target of rapamycin complex 1 (TORC1) is a master regulator of cell homeostasis, which promotes anabolic reactions and synchronously inhibits catabolic processes such as autophagy-mediated protein degradation. Its prime autophagy target is Atg13, a subunit of the Atg1 kinase complex that acts as the gatekeeper of canonical autophagy. To study whether the activities of TORC1 and Atg1 are coupled through additional, more intricate control mechanisms than simply this linear pathway, we analyzed the epistatic relationship between TORC1 and Atg1 by using quantitative phosphoproteomics. Our in vivo data, combined with targeted in vitro TORC1 and Atg1 kinase assays, not only uncover numerous TORC1 and Atg1 effectors, but also suggest distinct bi-directional regulatory feedback loops and characterize Atg29 as a commonly regulated downstream target of both TORC1 and Atg1. Thus, an exquisitely multilayered regulatory network appears to coordinate TORC1 and Atg1 activities to robustly tune autophagy in response to nutritional cues

Ischemic wound revascularization by the stromal vascular fraction relies on host-donor hybrid vessels

Nonhealing wounds place a significant burden on both quality of life of affected patients and health systems. Skin substitutes are applied to promote the closure of nonhealing wounds, although their efficacy is limited by inadequate vascularization. The stromal vascular fraction (SVF) from the adipose tissue is a promising therapy to overcome this limitation. Despite a few successful clinical trials, its incorporation in the clinical routine has been hampered by their inconsistent results. All these studies concluded by warranting pre-clinical work aimed at both characterizing the cell types composing the SVF and shedding light on their mechanism of action. Here, we established a model of nonhealing wound, in which we applied the SVF in combination with a clinical-grade skin substitute. We purified the SVF cells from transgenic animals to trace their fate after transplantation and observed that it gave rise to a mature vascular network composed of arteries, capillaries, veins, as well as lymphatics, structurally and functionally connected with the host circulation. Then we moved to a human-in-mouse model and confirmed that SVF-derived endothelial cells formed hybrid human-mouse vessels, that were stabilized by perivascular cells. Mechanistically, SVF-derived endothelial cells engrafted and expanded, directly contributing to the formation of new vessels, while a population of fibro-adipogenic progenitors stimulated the expansion of the host vasculature in a paracrine manner. These data have important clinical implications, as they provide a steppingstone toward the reproducible and effective adoption of the SVF as a standard care for nonhealing wounds

CNP e obesita': studio in un modello animale di ratto.

Introduzione: L’obesità è stata definita da “Centers for disease control” come una massa corporea di dimensioni maggiori rispetto al normale. È una malattia cronica multifattoriale dovuta non solo a cause genetiche, ma anche ambientali e legate allo stile di vita dell'individuo. L'obesità è anche un fattore di rischio indipendente per le malattie cardiovascolari, associato con sindrome metabolica e con incremento di mortalità e morbidità; inoltre è stata anche definita come un fattore di rischio per le malattie croniche renali e le patologie respiratorie. Alcune forme di obesità, tra cui quella addominale, tipica della sindrome metabolica, sono associate ad una lieve infiammazione cronica in cui i macrofagi si accumulano nel tessuto adiposo e producono citochine infiammatorie come TNF-alpha e IL-6. Recentemente ha assunto importanza il ruolo dei peptidi natriuretici (PN) nella regolazione del peso corporeo in quanto i loro livelli plasmatici risultano diminuiti nei pazienti obesi. È stata osservata una diminuzione dei livelli plasmatici dei PN nei soggetti obesi probabilmente attribuibile o ad un aumento del recettore di clearance o ad una diminuita produzione e minor rilascio di questi peptidi da parte dei miociti. Risulta comunque ancora poco chiaro quale sia il ruolo del peptide natriuretico di tipo C (CNP), un altro membro della famiglia dei PN insieme al peptide natriuretico di tipo A (ANP) e di tipo B (BNP). Attualmente è stato identificato nel sistema CNP/cGMP un importante regolatore naturale di adipogenesi, che potrebbe funzionare come fattore autocrino/paracrino, regolando eventi biologici della fase iniziale di questo processo. Scopo: Poiché il CNP è stato recentemente identificato avere un ruolo importante nella patologia cardiovascolare, ma anche renale e polmonare, scopo del mio lavoro di tesi è stato quello di studiare il coinvolgimento di questo peptide e del suo recettore specifico NPR-B nelle patologie principalmente coinvolte nell’obesità. In particolare lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di valutare le variazioni di espressione a livello di mRNA del CNP e del suo recettore specifico NPR-B in tessuto cardiaco, renale e polmonare di ratti Zucker di controllo e obesi. Al fine di ottenere una corretta normalizzazione dei dati ottenuti dagli esperimenti di Real-Time PCR, ulteriore obiettivo è stato quello di selezionare un set di geni di riferimento per il tessuto cardiaco, renale e polmonare nel modello animale sperimentale di obesità utilizzato. Per avere una visione più completa del sistema dei PN e del loro legame con i fattori infiammatori sono state inoltre valutate, negli stessi campioni, le variazioni di espressione di BNP, NPR-C, TNF-alpha e IL-6. Materiali e metodi: Sono stati studiati 20 ratti maschi Zucker di 9-11 settimane di età, suddivisi in due gruppi: ratti obesi (O, n=10, 351 g) e ratti di controllo (CO, n=10, 287 g) (Charles River Laboratories). Gli animali sono stati studiati in condizioni di digiuno (CO, n=5, glicemia= 118 mg/dl; O, n=5, glicemia= 379 mg/dl) e durante induzione di iperglicemia in seguito ad iniezione di un bolo di glucosio (CO, n=5, glicemia=351 mg/dl; O, n=5, glicemia=448 mg/dl). Da ciascun animale è stato prelevato tessuto cardiaco, renale e polmonare, per un totale di 60 campioni. L'RNA totale è stato estratto dai campioni tessutali con il metodo guanidina tiocianato-fenolo-cloroformio e ne è stata verificata integrità, purezza e concentrazione. L’espressione a livello di mRNA degli effettori è stata valutata attraverso reazioni di Real-Time PCR previo settaggio delle condizioni ottimali di reazione. Al fine di effettuare una corretta normalizzazione dei dati è stato valutato, per ciascun tessuto, un set di 10 geni di riferimento scelti tra i più studiati in letteratura (ACTB, TBP, GAPDH, SDHA, HPRT-1, Pol2ra, RPL13a, TFCR, YWHAG, PPIA). Le concentrazioni proteiche del CNP sono state misurate attraverso saggio radioimmunometrico specifico. Risultati:I geni di riferimento più stabili sono risultati essere: SDHA, HPRT-1 e TBP per il tessuto cardiaco, GAPDH, β-ACTINA e TBP per il tessuto renale e HPRT-1, SDHA e YWHAG per il tessuto polmonare. Nel tessuto cardiaco dei ratti obesi i livelli di mRNA del CNP sono risultati inferiori rispetto a quelli dei ratti CO come confermato anche dalle concentrazioni proteiche ottenute con la determinazione immunometrica (ratti CO: 0,36±0,07 vs. ratti O: 0,26 ± 0,07 pg/mg). Il BNP ha presentato un andamento analogo mentre l’espressione a livello di mRNA del sottotipo recettoriale NPR-B è risultata significativamente più elevata nei ratti O rispetto ai ratti CO. Il tessuto renale ha mostrato livelli di espressione di CNP e NPR-B simili per i ratti CO e per i ratti O, mentre nel polmone è stata osservata una diminuita espressione di CNP con un aumentata espressione di NPR-B nei ratti O rispetto ai ratti CO, anche se in maniera non significativa. Come per il tessuto cardiaco anche nei reni e nei polmoni le concentrazioni proteiche del CNP riflettono l’andamento osservato a livello di mRNA (rene - CO: 0,20±0,025 vs. O: 0,16 ± 0,01 pg/mg; polmone - CO: 0,46±0,027 vs. O: 0,41 ± 0,02 pg/mg). Quando i due gruppi studiati, CO e O, venivano ulteriormente suddivisi in ratti a digiuno e con iperglicemia acuta, l’andamento di espressione a livello di mRNA osservato per ciascun gene analizzato rimaneva inalterato. Una lieve tendenza all’aumento dei livelli di espressione del TNF-alpha nei ratti O e’ stata osservata in tutti i tessuti studiati mentre i livelli di IL-6 sono risultati significativamente diminuti esclusivamente nel tessuto cardiaco dei ratti O (p= 0,05 CO vs. O). Conclusioni: La selezione dei geni di riferimento per la normalizzazione dei dati di Real-Time PCR ci ha permesso di identificare per ciascun tessuto studiato, cardiaco, renale e polmonare, i geni più stabili nell’obesità, dato ad oggi mancante in letteratura. I dati ottenuti da questo lavoro hanno inoltre evidenziato una diminuzione dei livelli di espressione del CNP con una up-regulation del sottotipo recettoriale NPR-B nel tessuto cardiaco di ratti O rispetto ai ratti CO, sottolineando un coinvolgimento maggiore a livello del cuore rispetto agli altri organi e suggerendo che le minori concentrazioni plasmatiche di CNP, osservate nei pazienti obesi, potrebbero essere dovute ad un ridotto rilascio di questi peptidi da parte dei miociti

Indole-3-acetic acid is a physiological inhibitor of TORC1 in yeast.

Indole-3-acetic acid (IAA) is the most common, naturally occurring phytohormone that regulates cell division, differentiation, and senescence in plants. The capacity to synthesize IAA is also widespread among plant-associated bacterial and fungal species, which may use IAA as an effector molecule to define their relationships with plants or to coordinate their physiological behavior through cell-cell communication. Fungi, including many species that do not entertain a plant-associated life style, are also able to synthesize IAA, but the physiological role of IAA in these fungi has largely remained enigmatic. Interestingly, in this context, growth of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is sensitive to extracellular IAA. Here, we use a combination of various genetic approaches including chemical-genetic profiling, SAturated Transposon Analysis in Yeast (SATAY), and genetic epistasis analyses to identify the mode-of-action by which IAA inhibits growth in yeast. Surprisingly, these analyses pinpointed the target of rapamycin complex 1 (TORC1), a central regulator of eukaryotic cell growth, as the major growth-limiting target of IAA. Our biochemical analyses further demonstrate that IAA inhibits TORC1 both in vivo and in vitro. Intriguingly, we also show that yeast cells are able to synthesize IAA and specifically accumulate IAA upon entry into stationary phase. Our data therefore suggest that IAA contributes to proper entry of yeast cells into a quiescent state by acting as a metabolic inhibitor of TORC1

Impact of obesity on the expression profile of natriuretic peptide system in a rat experimental model.

Natriuretic peptides (NPs) play an important role in obesity and aim of this study was to evaluate, in cardiac tissue of obese Zucker rats (O, n = 29) their transcriptomic profile compared to controls (CO, n = 24) by Real-Time PCR study; CNP protein expression was evaluated by immunostaining and immunometric tests. Myocardial histology was performed, confirming no alteration of organ structure. While ANP and BNP are cardiac peptides, CNP is mainly an endothelial hormone; thus its expression, as well as that of NPR-B and NPR-C, was also evaluated in kidney and lung of an animal subgroup (n = 20). In heart, lower BNP mRNA levels in O vs CO (p = 0.02) as well as ANP and CNP (p = ns), were detected. NPR-B/NPR-A mRNA was similar in O and CO, while NPR-C was numerically lower (p = ns) in O than in CO. In kidney, CNP/NPR-B/NPR-C mRNA was similar in O and CO, while in lung CNP/NPR-C expression decreased and NPR-B increased (p = ns) in O vs CO. Subdividing into fasting and hyperglycemic rats, the pattern of mRNA expression for each gene analyzed remained unchanged. The trend observed in heart, kidney and lung for CNP protein concentrations and immunohistochemistry reflected the mRNA expression. TNF-α and IL-6 mRNA were measured in each tissue and no significant genotype effect was detected in any tissue. The main NP variations were observed at the cardiac level, suggesting a reduced release by cardiac cells. The understanding of mechanisms involved in the modulation of the NP system in obesity could be a useful starting point for future clinical study devoted to identifying new obesity treatment strategies

Dynamic dermoscopic and reflectance confocal microscopic changes of melanocytic lesions excised during follow-up

BACKGROUND: Digital dermoscopy follow-up (DDF) is useful in improving melanoma recognition, catching early changes over time, although benign nevi can also show changes. Reflectance confocal microscopy (RCM) improves melanoma diagnostic accuracy and decreases the number of unnecessary resections.OBJECTIVES: To evaluate dynamic dermoscopic and RCM changes during follow-up of equivocal melanocytic lesions and assess the impact of adjunctive RCM to DDF for melanoma diagnosis.METHODS: A retrospective, multicenter study of extra-facial atypical melanocytic lesions excised during follow-up was performed. Morphological changes were evaluated comparing dermoscopy and RCM baseline and follow-up images.RESULTS: 137 atypical melanocytic lesions were studied, including 14 melanomas and 123 benign nevi. Significantly greater changes in DDF of atypical network, regression, atypical streaks and asymmetrical growth and in dynamic RCM of atypical cells and dermal-epidermal junction (DEJ) disarray were note in melanomas. With adjunctive dynamic RCM and major changes at DDF, sensitivity reached 100% with 40.6% specificity.LIMITATIONS: Selected series of "difficult to recognize" lesions, with both DDF and dynamic RCM images.CONCLUSION: Adjunctive dynamic RCM improves early melanoma recognition sensitivity

CNP, NPR-B and NPR-C mRNA expression in renal and pulmonary tissue of control lean (CO, white bar) and obese Zucker rats (O, black bar).

<p>On the left side: <b>a)</b> CNP, <b>b)</b> NPR-B, <b>c)</b> NPR-C relative levels in kidney. On the right side: <b>d)</b> CNP, <b>e)</b> NPR-B, <b>f)</b> NPR-C relative levels in lung.</p

Correlations between a) BNP and NPR-A b) CNP and NPR-B in cardiac tissue of Zucker rats (CO+O).

<p>Correlations between a) BNP and NPR-A b) CNP and NPR-B in cardiac tissue of Zucker rats (CO+O).</p