Structural studies on E.coli DNA polymerase III clamp loader subcomplexes

Tesis doctoral inédita. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 22-10-201

Peripheral nerve involvement in myotonic dystrophy type 2 – similar or different than in myotonic dystrophy type 1?

Introduction Multisystem manifestations of myotonic dystrophies type 1 (DM1) and 2 (DM2) are well known. Peripheral nerve involvement has been reported in DM1 but not in genetically confirmed DM2. The aim of our study was to assess peripheral nerve involvement in DM2 using nerve conduction studies and to compare these results with findings in DM1. Methods We prospectively studied patients with genetically confirmed DM2 (n=30) and DM1 (n=32). All patients underwent detailed neurological examination and nerve conduction studies. Results Abnormalities in electrophysiological studies were found in 26.67% of patients with DM2 and in 28.13% of patients with DM1 but the criteria of polyneuropathy were fulfilled in only 13.33% of patients with DM2 and 12.5% of patients with DM1. The polyneuropathy was subclinical, and no correlation was found between its presence and patient age or disease duration. Conclusions Peripheral nerves are quite frequently involved in DM2, but abnormalities meeting the criteria of polyneuropathy are rarely found. The incidence of peripheral nerve involvement is similar in both types of myotonic dystrophy

Evidence for a relatively high proportion of DM2 mutations in a large group of Polish patients

Introduction: Myotonic dystrophies (DMs) type 1 (DM1) and type 2 (DM2) are autosomal dominant, multisystem disorders, considered the most common dystrophies in adults. DM1 and DM2 are caused by dynamic mutations in the DMPK and CNBP genes, respectively. Methods: Molecular analyses were performed by PCR and the modified RP-PCR in patients, in their at-risk relatives and prenatal cases. Results: The analysis of Polish controls revealed the range of 5-31 CTG repeats for DM1 and 110-228 bp alleles for DM2. Among 318 confirmed probands - 196 (62%) were DM1 and 122 (38%) – DM2. Within DM1families, 10 subjects carried a low expanded CTG tract (< 100 repeats), which resulted in a full mutation in subsequent generations. Two related individuals had unstable alleles–188 bp and 196 bp without common interruptions. Conclusion: The relative frequencies of DM1/DM2 among Polish patients were 68% and 32%, respectively, with a relatively high proportion of DM2 mutations (1.6:1)

Szybkie wykrywanie dużych ekspansji w postępującej padaczce mioklonicznej typu 1, dystrofii miotonicznej typu 2 i ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 8

Background and purpose Human genetic disorders associated with multiple unstable repeats resulting in long DNA expansions are difficult to identify by conventional polymerase chain reaction (PCR) in routine molecular testing, and therefore require time-consuming hybridisation. To improve and expedite the diagnostic methods for progressive myoclonus epilepsy (EPM1), myotonic dystrophy 2 (DM2) and spinocerebellar ataxia 8 (SCA8) caused by dynamic mutations, we adapted a repeat primed PCR (RP-PCR) assay which was previously developed for testing of other triplet repeat disorders. Material and methods The new algorithm for molecular analysis was to run a standard PCR to yield alleles in an amplifiable range and then run a RP-PCR to detect larger expansions. Electrophoresis and visualisation of PCR products on an automatic sequencer were applied to determine normal and pathogenic alleles comprising (C4GC4GCG)n in EPM1 in 44 subjects, (CCTG)n in DM2 in 76 individuals and (CTG)n in SCA8 in 378 patients. Results: The protocol combining conventional PCR and RP-PCR proved to be a rapid and reliable test to diagnose the above named disorders. Among 44 individuals tested for EPM1, two expanded alleles were identified in 7 patients. Out of 76 apparently homozygous subjects, RP-PCR allowed us to detect 56 expansions specific to DM2, and out of 378 ataxia patients, a large allele of the ATXN8OS gene (SCA8) was found in 25 subjects. Conclusions Here, for the first time, we report detection of large expansions in EPM1 and SCA8 patients. This RP-PCR assay is high throughput, reproducible and sensitive enough to be successfully used for diagnostic purposes.Wstęp i cel pracy Oparta na konwencjonalnej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) diagnostyka molekularna chorób związanych z niestabilnymi sekwencjami powtórzonymi bywa niewystarczająca do wykrycia ogromnych ekspansji, wówczas konieczne jest stosowanie hybrydyzacji. W celu usprawnienia analizy molekularnej trzech chorób wywoływanych mutacjami dynamicznymi: postępującej padaczki mioklonicznej (EPM1), dystrofii miotonicznej typu 2 (DM2) i ataksji rdzeniowo-móżdżkowej typu 8 (SCA8) zaadaptowano technikę RP-PCR (repeat primed PCR), którą uprzednio opracowano dla chorób powodowanych ekspansjami sekwencji trójnukleo-tydowych. Materiał i metody Oprócz standardowej reakcji PCR, w której uzyskiwano allele w zakresie możliwym do amplifikacji, celem detekcji większych ekspansji stosowano RP-PCR. Elektroforetyczny rozdział produktów PCR na automatycznym sekwenatorze umożliwiał analizę alleli z zakresu prawidłowego oraz patogennego, które zawierały dwunasto-nukleotyd (C4GC4GCG)n w EPM1 u 44 osób badanych, czteronukleotyd (CCTG)n w DM2 u 76 osób i trójnukleotyd (CTG)n w SCA8 u 378 pacjentów. Wyniki: Zastosowany protokół diagnostyczny oparty na konwencjonalnej reakcji PCR i RP-PCR pozwolił na szybkie otrzymanie wiarygodnych wyników testu genetycznego w kierunku wyżej wymienionych chorób. Spośród 44 osób poddanych analizie w kierunku EPM1 wyodrębniono 7 przypadków patogennej ekspansji. Wśród 76 osób z dystrofią mio-toniczną, których wyniki po standardowej reakcji PCR wskazywały na genotyp prawidłowy (homozygoty) zastosowanie reakcji RP-PCR umożliwiło identyfikację 56 osób z ekspansją powodującą DM2. Analogicznie w grupie 378 pacjentów z ataksją, w 25 przypadkach wykryto patogenne allele genu ATXN8OS (SCA8). Wnioski W pracy przedstawiono po raz pierwszy zastosowanie RP-PCR w diagnostyce molekularnej do wykrywania dużych ekspansji u pacjentów z podejrzeniem EPM1 i SCA8. Ze względu na wysoką wydajność, powtarzalność i czułość techniki RP-PCR może być stosowana do celów diagnostycznych

Występowanie ataksji rdzeniowo-móżdżkowych spowodowanych mutacjami dynamicznymi u pacjentów w populacji polskiej

Background and purpose Autosomal dominant spinocerebellar ataxias (SCAs) belong to a group of neurodegenerative disorders usually of adult age at onset. Predominant clinical features are progressive ataxia, dysarthria, as well as pyramidal signs and polyneuropathy. Molecular analysis allows particular types of SCA to be distinguished. Genetic tests are applied in 10 types of SCA resulting from dynamic mutations: SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7, SCA8, SCA10, SCA12, SCA17 and DRPLA. Material and methods DNA samples from 1598 patients with ataxia symptoms were analysed to establish the number of CAG/CTG repeats in respective genes excluding SCA10. Results We diagnosed 224 cases of SCA1 (120 families) and 49 cases of SCA2 (23 families). Moreover, presymptomatic testing was done in 85 individuals from SCA1 families and for 21 cases from SCA2 families. An increased number of CTG repeats in the SCA8 gene was observed in 14 families and in 3 families a rare type of SCA, SCA17, was detected. Conclusions Our data suggest that frequencies of some types of SCA in Poland are different from those in other European countries, with irregular distribution within the country. The most frequent types are SCA1 and SCA2. A striking feature of the Polish population is the lack of SCA3 – the most frequent type in Western Europe.Wstęp i cel pracy Ataksje rdzeniowo-móżdżkowe (SCA) o dziedziczeniu autosomalnym dominującym należą do grupy chorób zwyrodnieniowych układu nerwowego, zazwyczaj o późnym wieku zachorowania. W obrazie klinicznym dominują postępująca ataksja i dyzartria, obserwuje się również objawy piramidowe i polineuropatię. Badania molekularne umożliwiają obecnie rozróżnienie poszczególnych typów SCA. Wykonuje się je w przypadkach 10 typów SCA, u podłoża których leżą mutacje dynamiczne zlokalizowane w odpowiednich genach: SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7, SCA8, SCA10, SCA12, SCA17 i DRPLA. Materiał i metody Materiał do badań molekularnych stanowiły próbki DNA od 1598 pacjentów, u których obserwowano objawy ataksji. Analiza genetyczna polegała na ustaleniu liczby powtórzeń CAG/CTG we wszystkich wyżej wymienionych genach z wyjątkiem SCA10. Wyniki Stwierdzono 224 przypadki SCA1 w 120 rodzinach oraz 49 przypadków SCA2 (23 rodziny). Wykonano ponadto przedkliniczne molekularne badania u 85 osób z rodzin z SCA1 i u 21 osób z rodzin z SCA2. W 14 rodzinach stwierdzono nieprawidłową liczbę powtórzeń CTG w genie SCA8, a w 3 rodzinach bardzo rzadką postać ataksji – SCA17. Wnioski Uzyskane dane wskazują, że częstość występowania poszczególnych typów SCA w Polsce jest odmienna niż w innych krajach Europy, a ich rozmieszczenie na terenie kraju nierównomierne. Najczęściej występują SCA1 i SCA2, podczas gdy brak jest SCA3 – najbardziej rozpowszechnionego typu SCA w Europie Zachodniej

Rodzinne występowanie zespołu FXTAS powodowanego premutacją w genie FMR1

Premutacją w genie FMR1 jest związana z neurodegeneracyjnym zespołem charakteryzującym się występowaniem drżenia zamiarowego, ataksji chodu oraz zaburzeń funkcji poznawczych u osób powyżej 50. roku życia. W pracy przedstawiono przypadek 74-letniego mężczyzny z bardzo nasilonym drżeniem zamiarowym, niewielkim drżeniem pozycyjnym i ataksją chodu. Analiza genu FMR1 wykazała u probanda 91 powtórzeń CGG, co spełnia kryterium rozpoznania premutacji. 68-letnia siostra chorego z drżeniem głowy o niewielkim nasileniu jest nosicielką premutacji z liczbą powtórzeń 81 CGG, a młodszy brat, u którego występuje niewielkie drżenie głowy oraz drżenie pozycyjne, ma 98 powtórzeń CGG. Bezobjawowa córka probanda ma liczbę powtórzeń powyżej 120 CGG, ale jeszcze w zakresie premutacji. U jej córki, z upośledzeniem umysłowym w stopniu niewielkim, bez innych objawów neurologicznych, stwierdzono pełną mutację. W tej rodzinie ze zróżnicowanymi objawami klinicznymi zostały zidentyfikowane cztery osoby z premutacją i jedna z pełną mutacją w genie FMR1