Development of high-throughput yeast-cell-based bioreporter assays for specific monitoring of bisphenol A and chemical testing of endocrine disrupting compounds

Chemicalization of the modern society has become a topic of debate in the past few decades. Especially chemicals that affect the human reproduction and hormonal system, the so-called endocrine disrupting compounds, have raised concern in public and regulatory agencies. There is a growing need for suitable testing methods to screen endocrine disrupting potential of new and old chemicals. While the European Union chemical legislation REACH has increased the need of chemical testing methods, one of its targets is also to decrease the use of animals in these tests. It has been proposed that inexpensive high throughput in vitro assays could be used for initial screening of chemicals for further testing with other methods. In addition to chemical testing, environmental monitoring of endocrine disrupting compounds is important to assess the level of exposure and possible adverse effects of chemicals on humans and wildlife. Chemical analysis methods used in environmental monitoring are sensitive, but they are also laborious, expensive, and require specialized instruments. Consequently, robust biological methods have become valuable tools to measure endocrine disrupting potency of chemicals and environmental samples. For this purpose, several Saccharomyces cerevisiae yeast cell-based bioreporters utilizing different nuclear receptors have been developed. Yeast-cell-based bioreporter assays have several advantages in environmental analytics. In addition to being inexpensive, they are particularly useful in determining the bioavailability of contaminants. Yeast is also very tolerant towards toxicity of different sample matrices. Yeast nuclear receptor bioreporter assays have been used to determine the total hormonal activity of samples containing unknown mixture of chemicals. However, these assays cannot identify the chemicals in the sample, and thus, monitoring of a single chemical has not been possible. Many cell-based assays have already been adapted to high throughput screening plate formats of 384 and 1536 wells and even higher. However, nearly all yeast nuclear receptor bioreporter assays are still performed in 96-well plates. Consequently, yeast bioreporter assays should be adapted to automated liquid handling and high density well plates to enable screening of large chemical libraries and high number of samples. In this thesis study, a yeast nuclear receptor bioreporter assay for specific detection of a single chemical, bisphenol A (BPA) was developed. The creation of the BPA-targeted receptor included application of a oligonucleotide-based mutation method and a positive-negative genetic selection method for human estrogen receptor α (publication I). Chemical specificity of the BPA-targeted receptor (BPA-R) bioreporter assay was characterized, and its use demonstrated with chemical mixture and waste water samples (publication II). In addition, the existing battery of yeast bioreporters was adapted to automated liquid handling and high density 384 and 1536 well plates to meet the requirements of high throughput screening (publication III). Finally, a new yeast-based bioreporter utilizing a chimeric human retinoid X receptor was constructed and characterized (publication IV). This bioreporter can be used to measure organotin compounds such as tributyl tin in environmental samples.Kemikaalit ovat osa modernia maailmaamme. Lähes kaikkien käyttämiemme tuotteiden - jopa elintarvikkeiden - valmistuksessa on käytetty erilaisia kemikaaleja takaamaan niiden haluttu koostumus, laatu ja turvallisuus. Kemikaalien turvallisuus ja ihmisten elinympäristön kemikalisoituminen on kuitenkin herättänyt viime vuosi-kymmeninä huolta niin suuressa yleisössä kuin viranomaisissakin. Erityisesti salakavalalta tuntuvat hormonitoimintaan vaikuttavat kemikaalit ovat huolestuttaneet ihmisiä. Näiden ns. hormonihäritsijäkemikaalien on epäilty aiheuttavan mm. lisääntymis¬terveydellisiä, hermostollisia ja aineenvaihdunnan ongelmia. Tällaisia kemikaaleja ovat esim. torjunta-aineet, dioksiinit, monet palonestoaineet, muovi-teollisuuden käyttämät ftalaatit ja bisfenoli A sekä orgaaniset tinayhdisteet. Euroopan Unionin kemikaaliasetus REACH tähtää kohti turvallisempaa kemikaalien käyttöä. Sen tarkoituksena on laajentaa kemikaalien erilaisten vaikutusten testaamista, saattaa testien teettäminen kemikaalien valmistajien vastuulle sekä parantaa käyttö-turvallisuuden tiedonkulkua kemikaalien tuottajilta niiden käyttäjille. Kemikaalien testaus¬vaatimusten lisääntyessä myös uusien testausmenetelmien tarve kasvaa. Eläinkokeiden sijaan REACH pyrkii suosimaan tehokkaampia ja eettisempiä menetelmiä, kuten in vitro eli ns. koeputkessa tehtäviä solu- ja kudospohjaisia määrityksiä. Hormonihäiritsijäkemikaalien testauksessa sieniin kuuluva tavallinen leivinhiiva (lat. Saccharomyces cerevisiae) on osoittautunut hyväksi työkaluksi. Eläinsoluihin verrattuna hiivaa on edullista ja helppoa viljellä ja muokata. Vaikka hiivasoluilta puuttuu eläin¬solujen tumareseptoreihin perustuva hormonien viestinvälitysketju, tämä ketju voidaan saada toimimaan myös hiivassa. Monet ihmisen hormonireseptorit, kuten estrogeeni¬reseptori, on onnistuneesti siirretty hiivaan. Kun hiiva altistetaan reseptoriin sitoutuvalle kemikaalille, reseptori aktivoituu ja tuottaa solussa ulkoisesti havaittavan signaalin. Tätä signaalia mittaamalla voidaan arvioida kemikaalin mahdollista vaikutusta kyseiseen hormonireseptoriin ja sen säätelemiin viestinvälitysketjuihin. Yksittäisten kemikaalien vaikutusten testaamisen lisäksi hiivasolumenetelmät soveltuvat myös erilaisten tuntemattomien ja puhdistamattomien näytteiden analysointiin. Tällaisia näytteitä ovat esim. ympäristö- ja vesinäytteet tai vaikkapa elintarvike¬näytteet. Hiivan avulla voidaan siis seurata ja arvioida ympäristön ja ihmisten mahdollista altistumista hormonaalisesti aktiivisille yhdisteille ja niiden seoksille. Tässä väitöskirjatyössäni olen vienyt eteenpäin olemassa olevia ja kehittänyt uusia hiivasoluihin perustuvia hormonaalisten kemikaalien testausmenetelmiä. Julkaisussa (I) suunnittelin menetelmän ihmisen estrogeenireseptorin rakenteen muokkaamiseen, ja sovelsin menetelmää kehittääkseni reseptorin, joka aktivoituu vain yhden valitun kemikaalin, bisfenoli A:n, sitoutuessa siihen. Julkaisussa (II) tätä muokattua reseptoria käytettiin spesifisen bisfenoli A:ta mittaavan hiivamenetelmän kehittämiseen. Tätä menetelmää voidaan soveltaa bisfenoli A:n mittaamiseen erilaisissa näytteissä, ja arvioimaan altistusta tälle kemikaalille eri lähteistä. Julkaisussa (III) siirsin olemassa olevien käsin pipetoitavien hiivamenetelmien käytön perinteisestä 96-kuoppa-levymittauksesta pipetointirobotin avulla 384- ja 1536-kuoppalevyillä tehtäviin määrityksiin. Menetelmä mahdollistaa tehokkaamman analysoinnin ja laajempien näyte-määrien mittaamisen. Julkaisussa (IV) suunnittelin ja olin mukana toteuttamassa uutta hiivamenetelmää, jonka avulla voidaan mitata orgaanisia tinayhdisteitä. Menetelmän avulla voidaan mitata ja arvioida tinayhdisteiden biosaatavuutta ja sedimentin saastuneisuuden astetta esim. laivaväylillä

Impact of copper and zinc on the growth of saprotrophic fungi and the production of extracellular enzymes

Peer reviewe