Etudes des facteurs moléculaires responsables de la spécificité de cofacteur des déshydrogénases à NAD(P)

Non disponible / Not availableNous avons utilisé la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase de type phosphorylante (GAPDH) comme enzyme modèle pour étudier la spécificité de cofacteur des oxydoréductases à NAD(P). En combinant connaissance de la structure tridimensionnelle de la GAPDH glycolytique NAD-dépendante de bacillus stearothermophilus et comparaisons de séquences primaires avec les GAPDH chloroplastiques NAD(P)-dépendantes, nous avons produit et étudié une série de mutants de la GAPDH NAD-dépendante au niveau de la liaison du NAD et du NADP. L'absence d'activité de l'enzyme de type sauvage avec le NADP proviendrait de facteurs moléculaires stériques et de la répulsion électrostatique entre le groupement 2'-phosphate du NADP et le résidu ASP32. Les triples mutations d32a-l187a-p188s (d32a-s) et d32g-l187a-p188s (d32g-s) entrainent une inversion de la spécificité de cofacteur en faveur du NADP, les enzymes mutées étant 2 et 4 fois plus efficaces avec le NADP qu'avec le NAD. Les valeurs maximales d'efficacité enzymatique et d'affinité avec le NADP sont observées pour le mutant D32G-S, mais avec un rapport K#C#A#T/K#M demeurant 33 et 55 fois inferieur a celui de l'enzyme glycolytique sauvage avec le NAD et de l'enzyme chloroplastique avec le NADP, respectivement. Les substitutions l33t-t34g-d35g sur le mutant S conduisent à une faible augmentation de l'affinité et de l'efficacité catalytique avec le NADP. D'autres déterminants structuraux de la GAPDH chloroplastique interviennent donc pour rendre compatibles la présence du 2'-phosphate du NADP avec celle de D32. L'étude du mécanisme réactionnel suggère que ces mutations provoquent un changement de l'étape limitant de la réaction, liée à une altération de la transition conformationnelle induite par la liaison du cofacteur. Ces résultats, comparés a la littérature, suggèrent que le caractère strict de la NAD-spécificité de nombreuses oxydoréductases dépend de facteurs structuraux généraux comme le résidu D32, mais aussi spécifiques à chaque enzyme, comme les déterminants de type quaternaire L187 et P188 de la GAPDH et que les modalités de liaison du NAD aux déshydrogénases à dualité de cofacteur NAD et NADP sont analogues à celles des enzymes strictement NAD-dépendantes

Combining isothermal titration calorimetry, fluorescence anisotropy and kinetic approaches to decipher the molecular mechanisms of the redox activation of the Yap1 transcription factor in S. cerevisiae.

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The biological chemistry of zinc

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Enzymologie moléculaire d'une sulfinyl réductase, la sulfirédoxine (Caractérisation du mécanisme catalytique)

Les peroxyrédoxines à deux cystéines typiques (2-Cys Prx) sont impliquées dans la résistance des cellules au stress oxydant associé à H2O2, en réduisant H2O2 en H2O. En parallèle, ces enzymes participent à la transduction du signal dépendant de H2O2 en tant que second messager, via leur état rédox. La suroxydation sous forme d acide sulfinique des 2-Cys Prx typiques eucaryotes est une modification posttraductionnelle qui inactive l activité peroxydase, permettant de réguler le passage du message cellulaire H2O2-dépendant. La réduction de cette espèce oxydée est essentielle pour la viabilité des cellules. Cette réaction est catalysée par les sulfirédoxines (Srx). Les études réalisées ont permis de caractériser le mécanisme catalytique de Srx de S. cerevisiae qui consiste en : 1) l activation de la fonction acide sulfinique sous forme d anhydride phosphoryl sulfinique, par transfert direct du phosphate ? de l ATP ; 2) la réduction de la fonction acide sulfinique activée par attaque de la Cys catalytique de Srx, ce qui conduit à un intermédiaire covalent thiosulfinate Prx/Srx ; 3) le recyclage de Srx avec la libération de PrxSOH. Au niveau du recyclage de l activité Srx, deux classes de Srx peuvent être définies, celle à deux Cys et celle à une Cys. La classe de Srx à deux Cys, composée jusqu à présent de Srx de levures, possède une Cys de recyclage qui attaque le thiosulfinate au niveau de la Cys de Srx, libérant la PrxSOH et la Srx oxydée sous forme de pont disulfure intramoléculaire. Cette forme oxydée de Srx est ensuite reconnue et réduite par la thiorédoxine. La classe de Srx à une Cys dont font partie les Srx de mammifères, ne possédant pas de Cys de recyclage, passe par un mécanisme de recyclage impliquant un réducteur autre que la Trx, qui reduit directement la fonction thiosulfinate, et dont la nature reste à déterminer.Typical two-cysteine peroxiredoxines are involved in cell resistance against H2O2-induced oxidative stress, by reducing H2O2 in H2O. Furthermore, these enzymes take part in H2O2 signalling, which is transmitted and regulated by their redox state. The eukaryotic typical 2-Cys Prxs are subject to post-translational modification under sulfinic acid oxidation state, which inactivates have lost their peroxidase activity and thus regulates allows the passage of H2O2-dependent cellular message. Reduction of the sulfinic acid oxidation state is essential for the cell viability. Sulfiredoxin (Srx) catalyzes this reduction. These research studies demonstrated that the catalytic mechanism of Srx occurs in three steps: first, the sulfinic acid is activated as a sulfinyl phosphoryl anhydride intermediate by a direct transfer of the ?-phosphate of ATP; second, the activated sulfinic acid intermediate is reduced via attack of the catalytic Cys of Srx, which leads to formation of a thiosulfinate intermediate and; third Srx, is recycled with concomitant release of the PrxSOH product of the reaction. Two classes of Srx could be defined depending on the mechanism of Srx recycling. The class comprising yeast Srxs have one recycling Cys. This Cys attacks the thiosulfinate intermediate, resulting in PrxSOH release and formation of an oxidized Srx intermediate. This oxidized species, with an intramolecular disulfide bond, is recognized and reduced by thioredoxin. In the class comprising Srx devoid of recycling Cys, which includes the mammalian Srxs, Srx is recycled by a reducer distinct from thioredoxin, which reduces directly the thiosulfinate function.NANCY1-Bib. numérique (543959902) / SudocSudocFranceF

Active site loop dynamics controls cofactor flip during the catalytic cycle in hydrolytic aldehyde dehydrogenases

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Studing redox enzymes interactions at the single-molecule level. Restitution des PEPS Mirabelle

Restitution des PEPS Mirabell

Active site loop dynamics controls cofactor flip during the catalytic cycle in hydrolytic aldehyde dehydrogenases

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Redox signaling : insights into the interaction mechanism of sulfiredoxin with peroxiredoxin and ATP

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