The proprotein convertase PC5/6 is protective against intestinal tumorigenesis: in vivo mouse model

BACKGROUND: The secretory basic amino acid-specific proprotein convertases (PCs) have often been associated with cancer/metastasis. By controlling the cleavage of cancer-associated proteins, PCs play key roles in multiple steps of cancer development. Most analyses of the implication of PCs in cancer/metastasis relied on the use of in vitro overexpression systems or inhibitors that can affect more than one PC. Aside from the role of furin in salivary gland tumorigenesis, no other in vivo genetic model of PC-knockout was reported in relation to cancer development. RESULTS: Since PC5/6 is highly expressed in the small intestine, the present study examined its in vivo role in intestinal tumorigenesis. Analysis of human intestinal tumors at various stages showed a systematic down-regulation of PC5/6 expression. Since gene inactivation of PC5/6 leads to lethality at birth, we generated mice lacking PC5/6 in enterocytes and analyzed the impact of the presence or absence of this PC in the mouse ApcMin/+ model that develops numerous adenocarcinomas along the intestinal tract. This resulted in viable mice with almost no expression of PC5/6 in small intestine, but with no overt phenotype. The data showed that by themselves ApcMin/+ tumors express lower levels of PC5/6 mRNA, and that the lack of PC5/6 in enterocytes results in a significantly higher tumor number in the duodenum, with a similar trend in other intestinal segments. Finally, the absence of PC5/6 is also associated with a premature mortality of ApcMin/+ mice. CONCLUSION: Overall, these data suggest that intestinal PC5/6 is protective towards tumorigenesis, especially in mouse duodenum, and possibly in human colon.This work was supported by Canadian Institutes of Health Research grant # 44363, a Canada Chair # 201652, and a Strauss foundation grant

Disruption of the expression of the proprotein convertase PC7 reduces BDNF production and affects learning and memory in mice

PC7 belongs to the proprotein convertase family, whose members are implicated in the cleavage of secretory precursors. The in vivo function of PC7 is unknown. Herein, we find that the precursor proBDNF is processed into mature BDNF in COS-1 cells coexpressing proBDNF with either PC7 or Furin. Conversely, the processing of proBDNF into BDNF is markedly reduced in the absence of either Furin or PC7 in mouse primary hepatocytes. In vivo we observe that BDNF and PC7 mRNAs are colocalized in mouse hippocampus and amygdala and that mature BDNF protein levels are reduced in these brain areas in PC7 KO mice but not in the hippocampus of PC1/3 KO mice. Various behavioral tests reveal that in PC7 KO mice spatial memory is intact and plasticity of responding is mildly abnormal. Episodic and emotional memories are severely impaired, but both are rescued with the tyrosine receptor kinase B agonist 7,8-dihydroxyflavone. Altogether, these results support an in vivo role for PC7 in the regulation of certain types of cognitive performance, in part via proBDNF processing. Because polymorphic variants of human PC7 are being characterized, it will be important in future studies to determine their effects on additional physiological and behavioral processes

Etude du métabolisme du précurseur du peptide amyloide de la maladie d'Alzheimer dans différents modèles cellulaires

Le principal constituent des dépôts amyloïdes des plaques séniles de la maladie d’Alzheimer est un peptide de 39 à 43 acides aminés appelé peptide amyloïde ou Aβ. Le peptide amyloïde dérive d’une protéine transmembranaire de 110 à 140 kDa (APP) codée par un gène localisé sur le chromosome 21. L’APP est soumis à deux voies cataboliques : amyloïdogène et non amyloïdogène, les enzymes impliquées dans ces deux voies ne sont pas encore identifiés. Dans certaines formes héréditaires de la maladie d’Alzheimer, des mutations ont été identifiées dans le gène de l’APP, ces mutations peuvent altérer le métabolisme de l’APP et provoquer une apparition précoce de la maladie. Dans une famille suédoise touchée par la maladie d’Alzheimer, la conversion d’une guanine en thymidine et d’une adénine en cytosine entraîne la substitution de deux acides aminés du côté N -terminal du peptide amyloïde. Des cellules transfectées par l’ADNc de la forme suédoise produisent 6 à 8 fois plus de peptide amyloïde que les cellules exprimant la forme normale de l’APP. Bien que ces mutations soient rares, elles démontrent l’importance du métabolisme de l’APP dans le développement de la maladie d’Alzheimer. Les mécanismes cellulaires permettant la production du peptide amyloïde à partir de son précurseur, ainsi que son accumulation dans le milieu extracellulaire doivent encore être élucidés. Dans ce but, nous avons utilisé, au cours de ce travail, trois modèles cellulaires pour étudier le métabolisme de l’APP humain, de cellules CHO transfectées et des neurones corticaux d’embryons de rat infectés par un adénovirus recombinant pour l’APP humain. Les cellules d’insectes infectées produisent de l’APP humain en grande quantité, à la fois dans les cellules et dans le milieu de culture ; l’APP soluble sécrété par ces cellules est formé de l’APP tronqué résultant de l’action de l’α-sécrétase et de l’APP complet libéré dans le milieu. La production de l’APP est maximale après 48h d’infection et diminue pour des incubations plus longues. Malgré une production très importante de l’APP par les cellules Sf9 infectées, le peptide amyloïde n’est pas détecté dans le milieu de culture. Cette absence de production du peptide amyloïde résulte de l’absence des activités β et γ-sécrétase dans ces cellules. une analyse du milieu de culture des cellules CHO transfectée nous a permis de montrer que ces cellules sont capables de métaboliser l’APP humain par les deux voies cataboliques. L’inhibition de l’endocytose de l’APP membranaire par une délétion de la partie cytoplasmique contenant le signal d’internalisation empêche la formation du peptide amyloïde à partir de l’APP normal. Par contre, cette délétion n’a aucun effet sur la production du peptide amyloïde par la forme suédoise. Ceci montre l’existence de deux voies différentes de formation du peptide amyloïde ; au cours de la sécrétion constitutive de l’APP suédois, ou au cours de l’internalisation de l’APP normal par endocytose/ Ces résultats montrent que le transport intracellulaire de l’APP jour un rôle déterminant dans le choix de sa voie catabolique. Dans le cerveau, le peptide amyloïde est produit essentiellement par les neurones. Le transport des protéines dans les cellules d’insectes et les cellules CHO est différent de celui des neurones qui utilisent, pour le transport, des protéines exclusivement neuronales. Il est donc essentiel d’étudier le métabolisme de l’APP dans les neurones. Dans cet objectif, nous avons construit des adénovirus recombinants pour l’APP humain ; ces adénovirus recombinant ont permis d’étudier le métabolisme de l’APP dans des neurones corticaux d’embryons de rats en culture. L’utilisation d’un adénovirus recombinant pour le gène bactérien LasZ nous a permis de démontrer que les adénovirus constituent un moyen efficace pour le transfert et l’expression d’un gène étranger dans des cultures de neurones. L’analyse des extraits cellulaires et du milieu de culture des neurones infectés montre que les neurones corticaux de rats en culture utilisent les deux voies cataboliques pour métaboliser l’APP humain. La double mutation suédoise favorise le clivage de l’APP par l’activité β-sécrétase, ce qui entraîne une augmentation de la production du peptide amyloïde par les neuronesThèse de doctorat en sciences biomédicales (biologie moléculaire et cellulaire) -- UCL, 199

Is there a link between proprotein convertase PC7 activity and human lipid homeostasis?

A genome-wide association study suggested that a R504H mutation in the proprotein convertase PC7 is associated with increased circulating levels of HDL and reduced triglycerides in black Africans. Our present results show that PC7 and PC7-R504H exhibit similar processing of transferrin receptor-1, proSortilin, and apolipoprotein-F. Plasma analyses revealed no change in the lipid profiles, insulin or glucose of wild type and PC7 KO mice. Thus, the R504H mutation does not modify the proteolytic activity of PC7. The mechanisms behind the implication of PC7 in the regulation of human HDL, triglycerides and in modifying the levels of atherogenic small dense LDL remain to be elucidated

The proprotein convertase PC5/6 is protective against intestinal tumorigenesis: <it>in vivo </it>mouse model

Abstract Background The secretory basic amino acid-specific proprotein convertases (PCs) have often been associated with cancer/metastasis. By controlling the cleavage of cancer-associated proteins, PCs play key roles in multiple steps of cancer development. Most analyses of the implication of PCs in cancer/metastasis relied on the use of in vitro overexpression systems or inhibitors that can affect more than one PC. Aside from the role of furin in salivary gland tumorigenesis, no other in vivo genetic model of PC-knockout was reported in relation to cancer development. Results Since PC5/6 is highly expressed in the small intestine, the present study examined its in vivo role in intestinal tumorigenesis. Analysis of human intestinal tumors at various stages showed a systematic down-regulation of PC5/6 expression. Since gene inactivation of PC5/6 leads to lethality at birth, we generated mice lacking PC5/6 in enterocytes and analyzed the impact of the presence or absence of this PC in the mouse ApcMin/+ model that develops numerous adenocarcinomas along the intestinal tract. This resulted in viable mice with almost no expression of PC5/6 in small intestine, but with no overt phenotype. The data showed that by themselves ApcMin/+ tumors express lower levels of PC5/6 mRNA, and that the lack of PC5/6 in enterocytes results in a significantly higher tumor number in the duodenum, with a similar trend in other intestinal segments. Finally, the absence of PC5/6 is also associated with a premature mortality of ApcMin/+ mice. Conclusion Overall, these data suggest that intestinal PC5/6 is protective towards tumorigenesis, especially in mouse duodenum, and possibly in human colon.</p

Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Type 9 Deficiency Reduces Melanoma Metastasis in Liver

High circulating cholesterol is associated with hypercholesterolemia, atherosclerosis, and stroke. However, the relation between cholesterol and tumorigenesis/metastasis is controversial. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) regulates low-density lipoprotein cholesterol homeostasis by targeting the low-density lipoprotein receptor (LDLR) for degradation. PCSK9 is mostly expressed in liver, which is one of the most common sites for metastatic disease. To reveal the function of PCSK9 and also evaluate the impact of cholesterol in liver metastasis development, B16F1 melanoma cells were injected into wild-type (WT) and Pcsk9-/- mice to induce liver metastasis. On chow diet, Pcsk9-/- mice harbored two-fold less liver metastases than WT mice. This decrease is related to low cholesterol levels in Pcsk9-/- mice, as the protection was lost after normalizing Pcsk9-/- cholesterol levels by a 2-week high cholesterol diet. Furthermore, a prolongation of this diet strongly increased metastasis in both genotypes, suggesting that high cholesterol levels promote metastatic progression. The protective effect of the PCSK9 deficiency is also associated with increased apoptosis in liver stroma and metastases. Tumor necrosis factor.α (TNFα) mRNA and protein were, respectively, higher in liver stroma and plasma of injected mice, likely increasing the apoptotic TNFα signaling. Furthermore, the anti-apoptotic factor B-cell lymphoma 2 was downregulated. TNFα regulation is LDLR-independent, as its mRNA level was similarly upregulated in mice lacking both PCSK9 and LDLR. Our findings show that PCSK9 deficiency reduces liver metastasis by its ability to lower cholesterol levels and by possibly enhancing TNFα-mediated apoptosis

Deletion of the Gene Encoding Proprotein Convertase 5/6 Causes Early Embryonic Lethality in the Mouse

PC5 belongs to the proprotein convertase family and activates precursor proteins by cleavage at basic sites during their transit through the secretory pathway and/or at the cell surface. These precursors include prohormones, proreceptors, growth factors, adhesion molecules, and viral glycoproteins. The Pcsk5 gene encodes two alternatively spliced isoforms, the soluble PC5A and transmembrane PC5B. We have carefully analyzed the expression of PC5 in the mouse during development and in adulthood by in situ hybridization, as well as in mouse tissues and various cell lines by quantitative reverse transcription-PCR. The data show that adrenal cortex and intestine are the richest sources of PC5A and PC5B, respectively. To better define the specific physiological roles of PC5, we have generated a mouse Pcsk5(Δ4)-deficient allele missing exon 4 that encodes the catalytic Asp(173). While Δ4/+ heterozygotes were healthy and fertile, genotyping of progeny obtained from Δ4/+ interbreeding indicated that Δ4/Δ4 embryos died between embryonic days 4.5 and 7.5. These data demonstrate that Pcsk5 is an essential gene

New in vivo and ex vivo models for the experimental study of sheep scrapie: development and perspectives

International audienceSheep scrapie is a prototypical transmissible spongiform encephalopathy (TSE), and the most widespread of these diseases. Experimental study of TSE infectious agents from sheep and other species essentially depends on bioassays in rodents. Transmission of natural sheep scrapie to conventional mice commonly requires one or two years. In an effort to develop laboratory models in which investigations on the sheep TSE agent would be facilitated, we have established mice and cell lines that were genetically engineered to express ovine PrP protein and examined their susceptibility to the infection. A series of transgenic mice lines (tgOv) expressing the high susceptibility allele (VRQ) of the ovine PrP gene from different constructs was expanded. Following intracerebral inoculation with natural scrapie isolates, all animals developed typical TSE neurological signs and accumulated abnormal PrP in their brain. The survival time in the highest expressing tgOv lines ranged from 2 to 7 months, depending on the isolate. It was inversely related to the brain PrP content, and essentially unchanged on further passaging. Ovine PrP transgene expression thus enhanced scrapie disease transmission from sheep to mice. Such tgOv mice may bring new opportunities for analysing the natural variation of scrapie strains and measuring infectivity. As no relevant cell culture models for agents of naturally-occurring TSE exist, we have explored various strategies in order to obtain stable cell lines that would propagate the sheep agent ex vivo without prior adaptation to rodent. In one otherwise refractory rabbit epithelial cell line, a regulable expression of ovine PrP was achieved and found to enable an efficient replication of the scrapie agent in inoculated cultures. Cells derived from sheep embryos or from tgOv mice were also used in an attempt to establish permissive cell lines derived from the nervous system. Cells engineered to express PrP proteins of a specified sequence may thus represent a promising strategy to further explore, at the cellular level, various aspects of TSE diseases.Nouveaux modèles expérimentaux pour l’étude in vivo et ex vivo de l’agent de la tremblante: développement et perspectives. Les travaux effectués sur la tremblante du mouton, la plus répandue des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST), ont beaucoup apporté à la connaissance de ces maladies. L’étude expérimentale de l’agent causal, dans l’espèce ovine comme dans d’autres espèces, repose essentiellement sur l’inoculation au rongeur. La transmission de la tremblante naturelle à la souris exige communément un à deux ans. Afin de développer des modèles de laboratoire qui facilitent les recherches sur l’agent infectieux de la tremblante, nous avons établi des lignées de souris et de cellules exprimant la protéine de prion (PrP) ovine, et analysé leur susceptibilité à l’infection. Un ensemble de lignées de souris transgéniques (tgOv) pour un allèle du gène PrP conférant une sensibilité élevée à la maladie (allèle VRQ) ont été crées à l’aide de différentes constructions. Suite à l’inoculation intracérébrale de tremblante du terrain, les animaux ont développé des désordres neurologiques typiques d’EST, associés à une accumulation de PrP anormale dans le cerveau. Dans les lignées exprimant le taux le plus élevé de PrP, le temps de survie a été de 2 à 7 mois, selon l’isolat. Le temps de survie, inversement corrélé au taux d’expression dans le cerveau, n’a pas diminué lors de passages ultérieurs. Cette étude démontre que l’expression d’un transgène spécifiant la PrP ovine peut considérablement accélérer la transmission de la tremblante à la souris. De telles souris ouvrent de nouvelles perspectives en terme d’analyse de la diversité naturelle des souches de tremblante et de quantification de l’infectiosité. Face à l’absence de modèles permissifs à des agents responsables d’EST naturelle, nous avons également exploré plusieurs stratégies dans le but d’établir des lignées cellulaires stables qui permettent de propager l’agent ovin ex vivo, sans adaptation préalable au rongeur. L’expression inductible de PrP ovine dans une lignée épithéliale de cellules de rein de lapin, originellement réfractaire, a permis d’obtenir une multiplication efficace de l’agent pathogène dans les cultures infectées. Par ailleurs, des cellules dérivées d’embryon de mouton ou de souris tgOv ont été sélectionnées afin d’obtenir des lignées permissives d’origine nerveuse. L’utilisation de cellules génétiquement modifiées, exprimant une protéine PrP de séquence donnée, apparaît donc comme un moyen prometteur d’explorer plus avant, au niveau cellulaire, divers mécanismes associés à la réplication des agents responsables d’EST