"Avaliação da expressão de genes associados ao sistema imune durante os estágios de desenvolvimento do camarão Litopenaeus vannamei"

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2013.Os cultivos de camarão, tanto nas fazendas quanto nas larviculturas, são susceptíveis à ocorrência de mortalidades causadas por micro-organismos patogênicos, tais como vírus, bactérias e fungos. A grande maioria dos estudos sobre os mecanismos de defesa dos camarões enfocam principalmente a problemática ocorrida nos viveiros de cultivo com animais juvenis e adultos. Por outro lado, tais estudos são ainda escassos nas fases larvais e pós-larvais, mas são igualmente importantes, uma vez que enfermidades nesses estágios podem gerar perdas econômicas consideráveis para as larviculturas. Assim, o presente estudo teve como objetivo ampliar o conhecimento sobre a ontogenia do sistema imune durante o desenvolvimento de Litopenaeus vannamei, a espécie de camarão mais cultivada no mundo, através da avaliação da expressão de genes associados ao seu sistema imune utilizando RT-qPCR. Foram analisados 17 genes, de diferentes categorias funcionais, em subestágios de desenvolvimento: ovos fertilizados (0-4h e 7-11h pós-desova), Náuplios (I e V), Protozoeas (I e III), Misis (I e III) e Pós-larvas (2, 9 e 17). Todos os genes avaliados mostraram-se expressos no estágio de Pós-larva, o qual é o mais próximo de camarões juvenis. Os genes associados à defesa antiviral (Lv-Sid 1, LvDcr2 e Lv-Ago 2, LvDcr1, LvSVC1 e Lv-Ago 1), reconhecimento de micro-organismos (LvDscam), antioxidante (Lv-PRX), sinalização intracelular (fatores de transcrição LvDorsal e LvRelish) e apoptose (LvIAP) foram ubiquamente expressos de ovo a pós-larvas. Enquanto a expressão de genes envolvidos no sistema pró-fenoloxidase (LvproPO-1), a homeostasia (LvHHAP), coagulação (LvClot) e peptídeos antimicrobianos (Litvan PEN2, Litvan PEN3 e LvSty-II) não foi detectada em todos os subestágios. De maneira interessante, a expressão de genes de uma mesma família gênica (Litvan PEN2 e Litvan PEN3) não ocorreu simultaneamente em um mesmo subestágio de desenvolvimento. Por outro lado, os genes associados à defesa antiviral (LvDcr1/2, Lv-Ago 1/2 and Lv-Sid-1), fatores de transcrição (LvDorsal e xii LvRelish), defesa antioxidante (Lv-PRX) e apoptose (LvIAP) foram mais expressos no Ovo 0-4h em comparação ao Ovo 7-11h, sugerindo uma contribuição materna. A expressão de genes associados ao sistema imune nas fases larvais e pós-larvais de L. vannamei ressalta a importância de se conhecer o estabelecimento dos diferentes mecanismos de defesa ao longo do seu desenvolvimento. Assim, o presente estudo vem contribuir, de maneira original e pioneira, com informações a respeito da ontogenia de moléculas do sistema imune, especialmente àquelas associadas à defesa antiviral. Conhecimentos desta natureza poderão contribuir, em um futuro próximo, para o desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas que servirão para avaliar as condições de saúde de animais nos cultivos (larviculturas e fazendas), bem como para orientar à seleção genética de camarões mais resistentes à infecções microbianas e virais.Abstract : Shrimp farms and hatcheries are susceptible to mortalities events caused by pathogenic microorganisms, such as virus, bacteria and fungi. The great majority of studies related to the defense mechanisms of shrimp are focused in problems that occur mainly in juvenile and adult shrimp farming. Moreover, studies in the shrimp larval and post-larval stages are very limited but are equally important, since diseases can generate considerable economic losses in those stages. Thus, the present study was aimed to expand the knowledge on the ontogeny of the immune system during the development of Litopenaeus vannamei, the most cultivated shrimp species in the world, through the evaluation of gene expression associated with the immune system using RT-qPCR. The stages examined in this work included the fertilized egg (0h and 7h post spawns), nauplius (I and V), protozoea (I and III), Mysis (I and III) and postlarval (PL2, PL9 and PL17). As result, it was observed that all analyzed genes were expressed in the post-larval stage, which is the previous stage to juvenile shrimp. While genes associated to antiviral defense (LvDcr1, LvDcr2, Lv-Ago 1, Lv-Ago 2, Lv-Sid-1 and LvSVC-1), microorganisms recognition(LvDscam), antioxidant defense (Lv-PRX), intracellular signaling (transcription factors LvDorsal and LvRelish) and apoptosis (LvIAP) were constitutively expressed from egg to postlarvae; genes involved in the prophenoloxidase system (LvproPO-1), homeostasis (LvHHAP), coagulation (LvClot) and antimicrobial peptides (Litvan PEN2, Litvan PEN3 and LvSty-II) were not detected in all stages. Interestingly, the expression of the same gene family (Litvan PEN2 and Litvan PEN3) did not occur simultaneously during the development. In addition, genes associated with antiviral defense (LvDcr1, LvDcr2, Lv-Ago 1, Lv-Ago 2 and Lv-Sid 1), transcription factors (LvDorsal and LvRelish), antioxidant defense (Lv-PRX) and apoptosis (LvIAP) were more expressed in egg 0h compared to egg 7h, which suggests a maternal contribution. The expression of genes associated with the immune system in larval and postlarval stages of L. vannamei highlights the importance of understanding the establishment of different defense mechanisms throughout the organism development. Thus, the present study aims to contribute in an original and pioneering way, with information about the ontogeny of molecules of the immune system, with especial attention given to molecules associated with antiviral defense. Such knowledge can contribute in the near future for the development of biotechnological tools to evaluate the health of animals in culture (hatchery and farm), as well as the genetic selection of shrimps more resistant to microbial and viral infections

Caracterización molecular de los genes asociados a la resistencia antimicrobiana en Bartonella bacilliformis

Bartonella bacilliformis es el agente causal de la enfermedad de Carrión. Actualmente, en el Perú los casos se siguen presentando y se ha reportado fallas en el tratamiento. Hay muy pocas investigaciones acerca de la susceptibilidad a antimicrobianos, y no se tiene estandarizada una prueba de antibiograma para esta bacteria. Asímismo, aún no se conocen los mecanismos de resistencia ni las secuencias de los genes asociados a ellas en cepas nativas circulantes de Bartonella bacilliformis. Por ello, el objetivo fue caracterizar molecularmente los genes asociados a la resistencia antimicrobiana en cepas circulantes en zonas endémicas para evaluar si presentan o no mutaciones en estos genes. Se estandarizó una prueba de antibiograma utilizando la cepa B. bacilliformis CIP 57.18 colocándose los discos de antibióticos comerciales: ciprofloxacina (CIP, 5 µg), rifampicina (RD, 30 µg), eritromicina (E, 15 µg), gentamicina (CN, 15 µg), doxiciclina (DO, 30 µg), cloranfenicol (30 µg), ácido nalidíxico (AN, 5 µg) y levofloxacina (LVX, 5 µg). Todas las cepas ensayadas mostraron resistencia al ácido nalidíxico pero sensibilidad a ciprofloxacina, a excepción de la cepa USM-LMM-002 que presentó susceptibilidad disminuida a ciprofloxacina. El análisis de las proteínas que codifican los genes gyrA y parC implicados en la resistencia a estos antibióticos, determinó que ambos presentan una diferencia aminoacídica (Ser83 por Ala) en la región del QRDR en relación a la GyrA y ParC de E. coli. Interesantemente, esta Ala83 en GyrA y ParC sólo proporciona resistencia a ácido nalidíxico y no a ciprofloxacina, siendo necesaria la acumulación de mutaciones en gyrA para la resistencia a ciprofloxacina. Para los demás antibióticos, las cepas fueron sensibles y en el secuenciamiento de los genes (rpoB, L4 y 16S ribosomal) asociado a dichas resistencia no se encontró ninguna mutación. La resistencia constitutiva al ácido nalidíxico es una propiedad de B. bacilliformis, y sería un buen indicador de la susceptibilidad a las fluoroquinolonas pero su resistencia no está relacionada a la resistencia de otras fluoroquinolonas. Además, la sensibilidad a otros antibióticos como doxiciclina, rifampicina, cloranfenicol y gentamicina podría indicar alternativas en el tratamiento de esta enfermedad aunque ensayos clínicos serian necesarios.--- Bartonella bacilliformis is the causative agent of Carrion's disease. Currently in Peru are still present cases and are reported failures in treatment. There is very little research on antimicrobial susceptibility, nor has been standardized a test of sensitivity to the bacteria. Also, are not yet known resistance mechanisms and the sequences of genes associated with them in circulating native strains of Bartonella bacilliformis. Therefore, the objective was molecularly characterize the genes associated with antimicrobial resistance in isolates circulating in endemic areas to assess whether present or not mutations in these genes. Susceptibility testing was standardized using the strain of B. bacilliformis CIP 57.18 placing commercial antibiotic discs: ciprofloxacin (CIP, 5 µg), rifampin (RD, 30 µg), erythromycin (E, 15 µg), gentamicin (CN, 15 µg), doxycycline (DO, 30 µg), chloramphenicol (30 µg), nalidixic acid (NA, 5 µg) and levofloxacin (LVX, 5 µg). All strains tested showed resistance to nalidixic acid but sensitive to ciprofloxacin, except for strain USM-LMM-002 that presented reduced susceptibility to ciprofloxacin. The analysis of the proteins encoded by gyrA and parC genes involved in resistance to these antibiotics, determined that both have an aminoacid difference (Ser83 by Ala) in the QRDR region in relation to the GyrA and ParC of E. coli. Interestingly, the Ala83 in GyrA and ParC only provides resistance to nalidixic acid and not to ciprofloxacin, being necessary the accumulation of mutations in gyrA for ciprofloxacin resistance. For other antibiotics, the strains were sensitive and sequencing of genes (rpoB, and 16S ribosomal L4) associated with such resistance, there was no mutation. Constitutive resistance to nalidixic acid is a property of B. bacilliformis, and would be a good indicator of susceptibility to fluoroquinolones but this resistance is not related to resistance to other fluoroquinolones. In addition, sensitivity to other antibiotics such as doxycycline, rifampicin, chloramphenicol and gentamicin might suggest alternatives in the treatment of this disease, although clinical trials are needed.Tesi

Reporte del monitoreo ambiental en el marco de la supervisión regular en unidades de cervecería, llevado a cabo el 19 y 20 de Marzo de 2014, en la empresa Compañía Cervecera AMBEV PERÚ SA- Planta Huachipa

Reporte del monitoreo ambiental en el marco de la supervisión regular en unidades de cervecería, llevado a cabo el 19 y 20 de marzo de 2014, en la empresa Compañía Cervecera AMBEV PERÚ SA- Planta Huachipa. Para la ejecución del monitoreo utiliza la Resolución Jefatura! W 182-20 11-ANA: Protocolo Nacional de Monitoreo de la Calidad en Cuerpos Naturales de Agua Superficial. Señala los puntos de monitoreo, las muestras colectadas y los parámetros de análisis en laboratorio. No incluye los resultados analíticos del monitoreo ambiental. Contiene los siguientes anexos: copia de certificado de calibración de equipo, copia de cadena de custodia con sello de recepción del laboratorio, y registro fotográfico

Reporte del monitoreo ambiental en el marco de la supervisión regular en unidades de cervecería, llevado a cabo el 21 y 22 de Marzo de 2014, en la empresa Unión de Cervecerías Peruanas Backus y Johnston S.A.A. - Planta Ate.

Presenta el reporte del monitoreo ambiental de efluentes industriales realizado en el marco de la supervisión regular del subsector industrias, llevado a cabo el 21 y 22 de marzo de 2014, en la provincia de Lima, distrito Ate departamento de Lima. Señala los puntos de monitoreo, las muestras colectadas y los parámetros de análisis en laboratorio. No incluye los resultados analíticos del monitoreo ambiental. Contiene los siguientes anexos: copia de certificado de calibración de equipo, copia de cadena de custodia con sello de recepción del laboratorio, y registro fotográfico

Caracterización molecular de la región determinante de resistencia a quinolonas (QRDR) de la topoisomerasa IV de Bartonella bacilliformis en aislados clínicos

Bartonella bacilliformis is the etiologic agent of Carrion's disease, which if endemic to Peru. Studies on antimicrobial resistance genes from clinical isolates of this pathogen are scarce, and the molecular characteristics of these genes and their region resistance-associated are currently unknown. In this work we made the molecular characterization of the quinolone-resistance, and establish the region (QRDR) for the topoisomerase IV, which is encoded by the parC and parE genes, as well as develop an antimicrobial susceptibility test for B. bacilliformis. 65 Blood samples from La Libertad, Cusco, Ancash and Piura were processed on Blood Agar plates and incubated at 30 °C, 5% CO2. The antimicrobial susceptibility was determined, then the genomic DNA extracted, aforementioned genes amplified, their sequence determined and it analyzed using bioinformatics tools. Six positive cultures were obtained. The isolates were susceptible to Ciprofloxacin (except one strain from Quillabamba – Cusco, which showed decreased susceptibility) and were resistant to Nalidixic Acid. From the sequence analysis of B. bacilliformis ParC and ParE there have been shown amino acid differences compared to the respective protein sequences from E. coli K12 MG1655, which is likely to confer resistance to Nalidixic Acid but not to Ciprofloxacin. It was determined that B. bacilliformis ParC and ParE proteins QRDRs are comprised between amino acids 67 to 118 and 473 to 530, respectively. The antibiogram and the minimal inhibitory concentration are best assessed using the #1 McFarland standards after a 6-day incubation period.Bartonella bacilliformis es el agente etiológico de la Enfermedad de Carrión, endémica del Perú. Pocas investigaciones han sido realizadas acerca de los genes asociados a la resistencia antimicrobiana en aislados clínicos de este patógeno. Estos genes no están caracterizados molecularmente, ni se conoce la región asociada a dicha resistencia. Por ello, el objetivo del este trabajo fue caracterizar molecularmente la región determinante de la resistencia a las quinolonas (QRDR) en la topoisomerasa IV, que está codificada por los genes parC y parE, así como también desarrollar una prueba de susceptibilidad antimicrobiana para B. bacilliformis. Las muestras sanguíneas de 65 pacientes procedentes de La Libertad, Cusco, Ancash y Piura, se sembraron en placas de agar sangre e incubaron a 30 °C con 5% CO2. Luego se procedió a: (1) determinar la susceptibilidad antimicrobiana y (2) extraer el DNA genómico, amplificar los genes mencionados, secuenciarlos y analizarlos mediante herramientas bioinformáticas. Se obtuvieron 6 cultivos positivos. Los aislados fueron sensibles a la ciprofloxacina (excepto uno procedente de Quillabamba-Cusco, que presentó susceptibilidad disminuida) y resistentes al ácido nalidíxico. Del análisis de las secuencias aminoacídicas de ParC y ParE de B. bacilliformis se concluye que presentan diferencias aminoacídicas en comparación con las secuencias de las proteínas respectivas de E. coli K12 MG1655, que probablemente confieran resistencia al ácido nalidíxico pero no a la ciprofloxacina. Se determinó que las QRDR de las proteínas ParC y ParE de B. bacilliformis están comprendidas entre los aminoácidos 67 al 118 y 473 al 530, respectivamente. El antibiograma y la concentración mínima inhibitoria se evalúan mejor usando inóculos a escala 1 de McFarland y a los 6 días de incubación

Efeito citoprotetor de compostos orgânicos de selênio contra o dano oxidativo induzido por peróxido em uma linhagem de célula neuronal HT22: envolvimento do sistema antioxidante dependente de glutationa

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2018.O estresse oxidativo celular é um fator importante no desenvolvimento de várias doenças neurodegenerativas, especialmente as doenças de Alzheimer e de Parkinson. Dentre as regiões do encéfalo, o hipocampo, estreitamente ligado à memória e cognição, é comumente afetado em várias doenças neurodegenerativas. Na última década, um especial interesse tem sido dado ao estudo de compostos com propriedades protetoras que permitem prevenir ou reduzir o dano oxidativo nestas doenças neurodegenerativas. Neste contexto, no presente estudo foram avaliados os efeitos protetores de dois compostos orgânicos de selênio, (PhSe)2 e RC513, em uma cultura de células neuronais hipocampais HT22 expostas ao hidroperóxido de terc-butila (tBuOOH) (modelo de estresse oxidativo in vitro), bem como os mecanismos moleculares envolvidos na citoproteção. As células HT22 foram pré-tratadas com 2 µM de (PhSe)2 ou RC513 durante 48 horas e posteriormente expostas a tBuOOH (40 µM) durante: i) 12 h para avaliar a viabilidade e morte celular utilizando o ensaio MTT e IP; ii) 2-4 h para avaliar a taxa de consumo de oxigênio, usando respirometria de alta resolução; e iii) 2-4 h para avaliar a geração de espécies oxidantes usando H2DCFDA e MitoSOX. Os níveis de transcritos de Gpx1 e Gclc e atividade da glutationa peroxidase (GPx), níveis de glutationa (GSH) e tióis não proteicos (NPSH) também foram avaliados nas células HT22 após o pré-tratamento com (PhSe)2 ou RC513. O perfil temporal (3 h até 24 h) dos níveis de transcritos de genes alvos de Nrf2 e FoxO (Prdx2, Prdx3, Prdx5, Txnrd2, Sod2, Cat, HO-1, Gpx1 e Gclc) também foi avaliado. Os resultados mostram que o RC513 aumentou a expressão dos genes Gpx1, Prdx2 e Prdx5, enquanto o (PhSe)2 incrementou a expressão dos genes Gpx1, Cat, HO-1 e Gclc. Estes resultados sugerem que ambos compostos ativam as vias de sinalização Nrf2 e/ou FoxO nestas células. Ambos os compostos foram capazes de proteger as células HT22 contra o estresse oxidativo induzido pelo tBuOOH. A citoproteção mediada pelos compostos foi acompanhada da habilidade de ambos em reduzir a geração de oxidantes e prevenir a disfunção mitocondrial. O pré-tratamento das células com ambos compostos aumentou a atividade GPx e os níveis de transcritos do gene Gpx1. Alguns efeitos distintos foram verificados, como por exemplo, o (PhSe)2 além de aumentar a atividade GPx, este composto modulou positivamente os transcritos da Gclc correlacionando-se com o incremento dos níveis de GSH e NPSH nas células HT22, enquanto o RC513 não induziu modificações nestesparâmetros. Adicionalmente avaliamos o efeito do (PhSe)2 e do RC513 (0,5 µM e 2 µM) sobre a citotoxicidade induzida por outros agentes estressores (SIN-1, glutamato e MeHg). Os resultados indicaram que o pré-tratamento com (PhSe)2 ou RC513 (2 µM) evitou a dimunuição da viabilidade celular após exposição ao tBuOOH (400 µM), SIN-1 (2 mM), glutamato (10 mM) e MeHg (1000 nM). Um curto período de pré-tratamento com RC513 (2 µM, por 3 h) teve uma eficiência protetora melhor do que o (PhSe)2 mantendo a viabilidade celular após a exposição prolongada ao tBuOOH (40 µM). Alem disso, RC513 (0,5 µM) foi mais efetivo do que (PhSe)2 na citoproteção frente ao tBuOOH (40 µM), glutamato (5 mM) e MeHg (1000 nM). Em resumo, este estudo demonstra, pela primeira vez, os efeitos protetores dos compostos (PhSe)2 e RC513 em células neuronais HT22 expostas a oxidantes, mostrando algumas diferenças no mecanismo de proteção destes compostos. Os resultados do presente estudo sugerem e indicam que estes compostos são promissores como agentes neuroprotetores em condições relacionadas ao estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial.Abstract : Cellular oxidative stress is an important factor in the development of various neurodegenerative diseases, especially Alzheimer's and Parkinson's diseases. Among the regions of the brain, the hippocampus, closely linked to memory and cognition, is commonly affected in several neurodegenerative diseases. In the last decade, a special interest has been given to the study of compounds with protective properties that allow preventing or reducing oxidative damage in these neurodegenerative diseases. In this context, the protective effects of two organic selenium compounds (PhSe)2 and RC513 were evaluated in a culture of HT22 hippocampal neuronal cells exposed to tert-Butyl hydroperoxide (tBuOOH) (in vitro oxidative stress model), as well as the molecular mechanisms involved in their cytoprotection. HT22 cells were pretreated with 2 µM of (PhSe)2 or RC513 for 48 hours and then exposed to tBuOOH (40 µM) for: i) 12 h to assess viability and cell death using the MTT and PI assay; ii) 2-4 h to evaluate the oxygen consumption rate (OCR), using high-resolution respirometry; and iii) 2-4 h to evaluate the generation of oxidant species using H2DCFDA and MitoSOX. Levels of Gpx1 and Gclc transcripts and Glutathione peroxidase (GPx) activity, glutathione (GSH) and the non-protein sulfydryls (NPSH) levels were also evaluated in HT22 cells after pre-treatment with (PhSe)2 or RC513. The time profile (3 h to 24 h) of transcript levels of Nrf2- and FoxO-target genes (Prdx2, Prdx3, Prdx5, Txnrd2, Sod2, Cat, HO-1, Gpx1 and Gclc) was also evaluated. The results show that RC513 increased the expression of Gpx1, Prdx2 and Prdx5, while (PhSe)2 increased expression of the Gpx1, Cat, HO-1 and Gclc. These results suggest that both compounds activate the Nrf2 and/or FoxO signaling pathways in these cells. Both compounds were able to protect HT22 cells against the oxidative stress induced by tBuOOH. The cytoprotection mediated by the compounds was accompanied by the ability to both reduce the generation of oxidants and to prevent mitochondrial dysfunction. Pretreatment of the cells with both compounds increased the activity of GPx and the transcript levels of the Gpx1 gene. Some distinct effects were verified, such as (PhSe)2 in addition to increasing GPx activity, this compound positively modulated Gclc transcripts correlating with the increase of GSH and NPSH levels in HT22 cells, while RC513 did not induced changes in these parameters. Additionally, we evaluated the effect of (PhSe)2 and RC513 (0.5 µM and 2 µM) on cytotoxicity induced by other stressors (SIN-1, glutamate and MeHg). The results indicated that pre-treatment with (PhSe)2 or RC513 (2 µM) prevented the decrease in cell viability after exposure to tBuOOH(400 µM), SIN-1 (2 mM), glutamate (10 mM) and MeHg (1000 nM). A short pretreatment period with RC513 (2 µM, for 3 h) had a better protective efficiency than (PhSe)2 in maintaining cell viability after prolonged exposure to tBuOOH (40 µM). In addition, RC513 (0.5 µM) was more effective than (PhSe)2 on cytoprotection against tBuOOH (40 µM), glutamate (5 mM) and MeHg (1000 nM). In summary, this study demonstrates, for the first time, the protective effects of compounds (PhSe)2 and RC513 on HT22 neuronal cells exposed to oxidants, showing some differences in the mechanism of protection of these compounds. The results of the present study suggest and indicate that these compounds are promising as neuroprotective agents under conditions related to oxidative stress and mitochondrial dysfunction