Functional and structural characterization of phospholipases A2 isolated of Bothrops asper snake venom from Panamá.

Os envenenamentos causados pelas serpentes do gênero Bothrops são os mais importantes do ponto de vista médico e econômico na América Central. Dentre estas, a serpente Bothrops asper é responsável por 90% dos envenenamentos ofídicos registrados no Panamá anualmente. Apesar da relevância médica e econômica, só a peçonha de populações de B. asper da Costa Rica e Guatemala tem sido estudadas em detalhes. Neste trabalho apresentamos a caracterização da peçonha da B. asper do Panamá e o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de quatro fosfolipases A2 básicas denominadas MTX-I, MXT-II, MTX-III e MXT-IV e de uma fosfolipase A2acídica denominada Basp-I-PLA2. As fosfolipases A2 foram isoladas da peçonha em duas etapas usando cromatografia de troca iônica em CM-Sepharose (0,05 M NH4HCO3 pH 8,1), e cromatografia hidrofóbica em Fenil-Sepharose (0,05 M Tris-HCl pH 7,4) seguida de gradiente de concentração de 4 a 0 M NaCl no mesmo tampão a temperatura ambiente (25°C). A isoforma acídica demonstrou maior atividade catalítica que as isoformas básicas, quando atuou sobre fosfatidilcolina e fosfatidilglicerol. A focalização isoelétrica evidencia pIs de 8,1 a 8,3 para as MTXs e 4,6 para isoforma Basp-I-PLA2. A determinação da massa molecular por espectrometria de massa mostrou que MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 e MTX-3 14,253.0 e Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. As PLA2s (MTX-I, II, III e IV) induziram atividade miotóxica, reação inflamatória com migração de leucócitos ao músculo e ativação de macrófagos para exercer fagocitose e produção de superóxido. MTX-II exerceu um forte efeito citotóxico contra células tumorais JURKAT, C. albicans e E. coli. A fosfolipase A2 acídica, testada no plasma enriquecido com plaquetas, mostrou potente efeito inibitório na agregação plaquetária induzida pela ADP e colágeno. A análise de seqüência N- terminal demonstrou que as proteínas MTX-I, MTX-III e Basp-I-PLA2 pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Asp49 cataliticamente ativas, enquanto que, MTX-II e MTX-IV pertencem à subclasse de fosfolipases A2 Lys49-homólogas cataliticamente inativas. Além disso, a sequência N-terminal das fosfolipases A2 básicas isoladas, demonstrou claramente que as miotoxinas isoladas neste trabalho são similares às miotoxinas previamente isoladas da peçonha da B. asper da Costa Rica. A Basp-I-PLA2 é uma nova fosfolipase A2 acídica isolada da peçonha de B. asper do Panamá e sua seqüência N-terminal revelou uma alta homologia com outras PLA2s acídicas Asp49 isoladas de peçonhas de serpentes.Envenoming by Bothrops snakes is the most serious kind of envenoming from the medical and economical point of view in Central America. Bothrops asper snake is responsible for 90% of the snakebites registered in Panama every year. Despite its medical and economical relevance, only the venom of Costa Rica and Guatemala populations of this species has been studied to some detail, and there is very little information on intraspecies variability in venom composition and toxicity. In this study the crude venom of B. asper from Panama was characterized and its pharmacological and biochemistry activities were investigated with standard laboratory assays. Furthermore, we describe the isolation, functional and structural characterization of four basic phospholipases A2, named MTX-I, MTX-II, MTX-III, MTX-IV and a new acid phospholipase A2 named Basp-I-PLA2. The proteins were isolated from the crude venom by a combination of two chromatographic steps, using ion-exchange chromatography on CM-Sepharose (0.05 M NH4HCO3 pH 8.1 buffer), and hydrophobic chromatography on Phenyl-Sepharose (0.05 M Tris-HCl pH 7.4), followed by concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. Analyses of phospholipids hydrolyzed by these enzymes have shown that all phospholipases belong to type A2. The acidic isoform demostraded more catalytic activity than the basic PLA2s. This enzyme was more active on substrates as phosphotidylcholine and phosphatidylglycerol. The isoelectric focusing evidenced pIs beetwen 8.1 to 8.3 for the MTXs and 4.6 for the isoform Basp-I-PLA2. Its mol. Wt was estimated by Mass spectrometry to be MTX-1 14,156.5; MTX-2 14,249.5 and MTX-3 14,253.0 and Basp-I-PLA2 14,246.0 Da. The PLA2s (MTX-I, II, III and IV) induced myotoxic activity, inflammatory reaction mainly leukocyte migration to the muscle and activation of macrophages to exert phagocytic activity and production of superoxide. MTX-II, the most abundant one showed to be cytotoxic against JURKAT tumor cell line, C. albicans and E. coli. The acidic phospholipases A2 when tested in platelet rich plasma, showed a potent inhibitory effect on aggregation induced by ADP and collagen. The analysis of the sequence N-terminal demonstrated that the MTX-I, MTX-III and BASP-I-PLA2 belong to the subclass of Asp49 phospholipases A2 catalytically active, whereas, MTX-II and MTX-IV belong to proteins of the subclass of the enzymatically inactive Lys49 PLA2 s-like. In addition, a sequence of the region N-terminal of the PLA2s basic isolated, demonstrated clearly, that the isolated myotoxins in this work are similar of the previously isolated myotoxins of the snake venom Bothrops asper from Costa Rica. The Basp-I-PLA2 is a new acidic PLA2 and his sequence N-terminal revealed a high homology with other Asp49 acidic PLA2 s from snake venoms

Biochemical characterization, action on macrophages, and superoxide anion production of four basic Phospholipases A2 from Panamanian Bothrops asper Snake Venom

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Synergism of in vitro plasmodicidal activity of phospholipase A2 isoforms isolated from panamanian Bothrops asper venom

Bothrops asper is one of the most important snake species in Central America, mainly because of its medical importance in countries like Ecuador, Panama and Costa Rica, where this species causes a high number of snakebite accidents. Several basic phospholipases A2 (PLA2s) have been previously characterized from B. asper venom, but few studies have been carried out with its acidic isoforms. In addition, since snake venom is a rich source of bioactive substances, it is necessary to investigate the biotechnological potential of its components. In this context, this study aimed to carry out the biochemical characterization of PLA2 isoforms isolated from B. asper venom and to evaluate the antiparasitic potential of these toxins. The venom and key fractions were subjected to different chromatographic steps, obtaining nine PLA2s, four acidic ones (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III and BaspAc-IV) and five basic ones (BaspB-I, BaspB-II, BaspB-III, BaspB-IV and BaspB-V). The isoelectric points of the acidic PLA2s were also determined, which presented values ranging between 4.5 and 5. The findings indicated the isolation of five unpublished isoforms, four Asp49-PLA, corresponding to the group of acidic isoforms, and one Lys49-PLA2-like. Acidic PLA2s catalyzed the degradation of all substrates evaluated; however, for the basic PLA2s, there was a preference for phosphatidylglycerol and phosphatidic acid. The antiparasitic potential of the toxins was evaluated, and the acidic PLA2s demonstrated action against the epimastigote forms of T. cruzi and promastigote forms of L. infantum, while the basic PLA2s BaspB-II and BaspB-IV showed activity against P. falciparum. The results indicated an increase of up to 10 times in antiplasmodial activity, when the Asp49-PLA2 and Lys49-PLA2 were associated with one another, denoting synergistic action between these PLA2 isoforms. These findings correspond to the first report of synergistic antiplasmodial action for svPLA2s, demonstrating that these molecules may be important targets in the search for new antiparasitic agent

Primer congreso científico UNACHI 2015.

La Universidad Autónoma de Chiriquí (UNACHI), a través de la Vicerrectoría de Investigación y Postgrado (VIP), en cumplimiento de su misión, visión y objetivos estratégicos, realiza el Primer Congreso Científico del 5 al 9 de octubre de 2015, con el lema: “Impulsando la cultura, la ciencia y la humanidad”. En atención al Plan Estratégico del Gobierno de la República de Panamá 2015-2019; al Plan Estratégico Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (PENCYT) 2015-2019 de la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT); al Plan Estratégico Institucional 2013-2018 de la Universidad Autónoma de Chiriquí y a las Políticas de Investigación e Innovación de la Universidad, se presenta a la consideración de la comunidad científica universitaria y a la sociedad panameña, los resultados de las investigaciones correspondientes al período académico 2014-2015. Las investigaciones que hoy se presentan, corresponden a trabajos realizados por investigadores procedentes de nuestra institución, de universidades y centros de investigación del país y de investigadores procedentes de países hermanos, quienes comparten con nosotros los productos de sus muchas horas de trabajo realizadas en sus laboratorios, redes temáticas y giras de campo. El Congreso tiene sus antecedentes en los seis encuentros científicos realizados, anualmente en la universidad, desde el año 2009 hasta el año 2014. No obstante, dado el impulso y decidido respaldo de la Magnífica Rectora, Etelvina Medianero de Bonagas, al eje de investigación e innovación y al trabajo realizado por nuestros investigadores, se presentó ante el Consejo Académico N° 11-2015, del 16 de junio de 2015, la propuesta para elevar los encuentros a congreso científico, y que fue aprobada por unanimidad. Se convierte este evento académico, en un reto para la institución y a la vez en una gran oportunidad para el fortalecimiento de la investigación e innovación, al servicio de la sociedad y de los grandes temas de interés nacional. Con mucho agrado se puede señalar que en el Congreso se exponen conferencias magistrales, conferencias cortas, ponencias, mesas redondas, videoconferencias y dos exposiciones fotográficas tituladas: “Nuestros ríos, nuestro futuro” y “La luz en las ciencias”. Por segundo año consecutivo se realiza el reconocimiento al investigador del año; en esta oportunidad se honrará al connotado ambientalista Demetrio Miranda Miranda. Se presentan investigadores nacionales de la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación; de la Universidad Tecnológica de Panamá; del Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología; de la Universidad de Panamá; del Ministerio de Salud y de la Universidad Autónoma de Chiriquí. También se cuenta con investigadores internacionales procedentes de Estados Unidos, Honduras, Costa Rica y de República Dominicana. Los registros de los participantes, en la página web de la universidad, nos indican que durante el congreso se tendrá la participación de investigadores procedentes de las áreas de las ciencias económicas administrativas, de las ciencias de la salud, de las ciencias sociales y humanidades y de las ciencias naturales y exactas, estos últimos en un mayor porcentaje. Atendiendo a sus políticas institucionales, la UNACHI está cimentando las bases de un sistema de investigación e innovación, a través de acciones muy puntuales, las cuales aspiran a convertir a la Institución, en un centro de educación superior de excelencia y a disponer de un conjunto de investigadores de alto nivel. Con este propósito, se ha aprobado en el Consejo Académico, el Reglamento de Investigación e Innovación, donde se establece por primera vez, la figura del investigador a tiempo completo, a fin de impulsar la investigación en todas las áreas del conocimiento humano; se ha firmado un convenio con SENACYT para la reinserción de talentos en el nivel doctoral, a partir del año 2015, con miras a fortalecer la investigación científica y se han incrementado, significativamente, los fondos destinados a los subsidios de las investigaciones de las tesis de licenciatura, de las tesis de maestrías, de las tesis de doctorados y de los docentes investigadores, con proyectos que se encuentran en este momento en revisión por los evaluadores externos