Fast multiclonal clusterization of V(D)J recombinations from high-throughput sequencing

International audienceBACKGROUND: V(D)J recombinations in lymphocytes are essential for immunological diversity. They are also usefulmarkers of pathologies. In leukemia, they are used to quantify the minimal residual disease duringpatient follow-up. However, the full breadth of lymphocyte diversity is not fully understood. RESULTS: We propose new algorithms that process high-throughput sequencing (HTS) data to extract unnamedV(D)J junctions and gather them into clones for quantification. This analysis is based on a seedheuristic and is fast and scalable because in the first phase, no alignment is performed with germlinedatabase sequences. The algorithms were applied to TR HTS data from a patient with acutelymphoblastic leukemia, and also on data simulating hypermutations. Our methods identified themain clone, as well as additional clones that were not identified with standard protocols. CONCLUSIONS: The proposed algorithms provide new insight into the analysis of high-troughput sequencing data forleukemia, and also to the quantitative assessment of any immunological profile. The methodsdescribed here are implemented in a C++ open-source program called Vidjil

Fast multiclonal clusterization of V(D)J recombinations from high-throughput sequencing

International audienceBACKGROUND: V(D)J recombinations in lymphocytes are essential for immunological diversity. They are also usefulmarkers of pathologies. In leukemia, they are used to quantify the minimal residual disease duringpatient follow-up. However, the full breadth of lymphocyte diversity is not fully understood. RESULTS: We propose new algorithms that process high-throughput sequencing (HTS) data to extract unnamedV(D)J junctions and gather them into clones for quantification. This analysis is based on a seedheuristic and is fast and scalable because in the first phase, no alignment is performed with germlinedatabase sequences. The algorithms were applied to TR HTS data from a patient with acutelymphoblastic leukemia, and also on data simulating hypermutations. Our methods identified themain clone, as well as additional clones that were not identified with standard protocols. CONCLUSIONS: The proposed algorithms provide new insight into the analysis of high-troughput sequencing data forleukemia, and also to the quantitative assessment of any immunological profile. The methodsdescribed here are implemented in a C++ open-source program called Vidjil

Suivi de la leucémie résiduelle par séquençage haut-débit

National audienceLe séquençage à haut débit offre de nouvelles perspectives pour le suivi de la leucémie. Nous proposons un algorithme pouvant traiter des millions de séquences, capable de différencier les réarrangements V(D)J qui s'opèrent au sein des lymphocytes, et de les quantifier. Il est désormais possible de suivre une population clonale de lymphocytes ou de lymphoblastes au cours du temps et, en pathologie, de mesurer sa réaction au traitement. La méthode proposée est implémentée dans un logiciel open-source appelé Vidjil, et testée sur plusieurs échantillons d'un patient atteint de leucémie aiguë lymphoblastique

Diagnostic et suivi des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) par séquençage haut-débit (HTS)

National audienceLe diagnostic moléculaire des LAL permet, par la recherche de réarrangements V (D) J sur l’ADN des lymphoblastes, de mettre en évidence des marqueurs de clonalité dans 95% des cas. Ces marqueurs servent aussi à quantifier la maladie résiduelle par Q-PCR en temps réel (chimie Taqman) afin d’adapter au mieux la thérapeutique. Cette stratégie peut échouer dans les cas suivants : absence de marqueur initial, échec du séquençage ou enfin émergence à la rechute d’un clone non observé au diagnostic ou très minoritaire. Le HTS autorise désormais le séquençage profond d'une population lymphoïde et permet de contourner ces écueils. Ce travail explore l'utilisation de cette technologie pour le diagnostic et le suivi des LAL.La clonalité de 8 patients pédiatriques (5 LAL-B et 3 LAL-T, 2F/6M, 2 à 14 ans), au diagnostic et en suivi (37 points) a été étudiée . La sensibilité a été évaluée par une gamme de dilution d’ADN tumoral en ADN de PBL (de 10-2 à 10-5). Pour chaque échantillon, 500ng d’ADN médullaire sont extraits sur colonne Qiagen®, dosés sur NanoDrop® et amplifiés par les systèmes de PCR classiques, non fluorescents pour la cible TCRg et les IgH, systèmes décrits ou dérivés des travaux du Biomed-2. Les librairies de séquençages sont réalisées à partir des produits de PCR vérifiés sur gel d’agarose puis barre-codées et séquencées avec un séquenceur Ion Torrent (puce 318).Les séquences obtenues sont classées sur la base de leur réarrangement V (D) J par le logiciel Vidjil dédié (http : //bioinfo.lifl.fr/vidjil). Nous avons identifié les clones et leurs proportions respectives au diagnostic, et étudié leur évolution aux différents points de suivi. Nous avons retrouvé les clones détectés par les méthodes classiques mais aussi mis en évidence des clones minoritaires. Les rechutes ont été retrouvées, et, pour un patient, un clone émergent a été observé. L'ensemble de l'analyse validée, incluant la préparation, le séquençage et l'analyse informatique, semble plus rapide que par les protocoles actuels.Par la reconstruction de répertoires lymphoïdes, le HTS préfigure des avancées dans la connaissance des pathologies lymphomateuses et auto-immunes. Notre objectif est d’intégrer cette technologie dans le processus moléculaire de diagnostic et de suivi des LAL, ce qui pose aussi des défis de formation à l’analyse et l’interprétation des résultats et de praticité au sein d'un laboratoire d'hématologie. Le séquençage haut-débit, couplé à une analyse bioinformatique, donne une cartographie plus complète de la population blastique au diagnostic d’une LAL et permet d'observer l’évolution de cette population

Suivi de la leucémie résiduelle par séquençage haut-débit

National audienceLe séquençage à haut débit offre de nouvelles perspectives pour le suivi de la leucémie. Nous proposons un algorithme pouvant traiter des millions de séquences, capable de différencier les réarrangements V(D)J qui s'opèrent au sein des lymphocytes, et de les quantifier. Il est désormais possible de suivre une population clonale de lymphocytes ou de lymphoblastes au cours du temps et, en pathologie, de mesurer sa réaction au traitement. La méthode proposée est implémentée dans un logiciel open-source appelé Vidjil, et testée sur plusieurs échantillons d'un patient atteint de leucémie aiguë lymphoblastique

High-throughput sequencing in acute lymphoblastic leukemia: Follow-up of minimal residual disease and emergence of new clones

International audienceMinimal residual disease (MRD) is known to be an independent prognostic factor in patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL). High-throughput sequencing (HTS) is currently used in routine practice for the diagnosis and follow-up of patients with hematological neoplasms. In this retrospective study, we examined the role of immunoglobulin/T-cell receptor-based MRD in patients with ALL by HTS analysis of immunoglobulin H and/or T-cell receptor gamma chain loci in bone marrow samples from 11 patients with ALL, at diagnosis and during follow-up. We assessed the clinical feasibility of using combined HTS and bioinformatics analysis with interactive visualization using Vidjil software. We discuss the advantages and drawbacks of HTS for monitoring MRD. HTS gives a more complete insight of the leukemic population than conventional real-time quantitative PCR (qPCR), and allows identification of new emerging clones at each time point of the monitoring. Thus, HTS monitoring of Ig/TCR based MRD is expected to improve the management of patients with ALL