Untersuchungen basaler Transkriptionsfaktoren im Infektionsverlauf großer DNA-Viren

Das zentrale Interesse dieser Studien bestand darin, den Einfluss der Infektion großer DNA-Viren auf den basalen Transkriptionsapparat der Wirtszellen zu untersuchen. Die frühe Genexpression des Baculovirus AcMNPV erfolgt durch die zelluläre RNAP II. Die späten und die hyperexprimierten sehr späten viralen Gene werden hingegen durch eine viruskodierte RNA-Polymerase transkribiert. Es wird angenommen, dass der basale zelluläre Transkriptionsfaktor TBP in der frühen baculoviralen Transkription involviert ist, wohingegen eine Beteiligung von TBP an der späten Infektion unbekannt ist. Expressionsanalysen zeigten einen signifikanten Anstieg der TBP-Proteinmenge in der späten AcMNPV-Infektionsphase, der im Gegensatz zur beschriebenen virusinduzierten Abnahme der zellulären Genexpression stand. Somit ergab sich die Frage, wie der TBP-Anstieg durch das Virus induziert wird, und welche Bedeutung er für die Infektion hat. Nach Hemmung der Translation konnte eine hohe Stabilität von TBP nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu steht ein plötzlicher Abfall der gestiegenen TBP-Menge in infizierten TN-368-Zellen, so dass ein aktiver virusinduzierter Abbaumechanismus von TBP möglich ist. In Lokalisierungsstudien konnte kein direkter Zusammenhang dieses TBP-Abbaus mit dem Ubiquitin-Proteasomen-Weg hergestellt werden. In der ebenfalls permissiven Zelllinie Sf21 wurde der Abfall der TBP-Proteinmenge nicht beobachtet. Lokalisierungsstudien zeigten eine TBP-Relokalisierung von einem granulären Färbemuster im gesamten Zellkern in distinkte Kerndomänen ab der frühen Infektionsphase. Diese Kernstrukturen kolokalisierten mit viralen Replikationszentren und nahmen simultan und in Abhängigkeit von den Orten der viralen DNA-Synthese an Größe zu. In RNA-Interferenzstudien zur Analyse der Bedeutung der Baculovirus-induzierten TBP-Zunahme konnte die TBP-Proteinmenge nur in uninfizierten Zellen reduziert werden, nicht aber in der späten Infektionsphase. Die vergleichsweise durchgeführten Reduktionen der viralen Transkriptions- und Replikationsfaktoren IE2, DBP und LEF-4 zeigten keine Wirkungen auf die Expression der frühen viralen Proteine und von TBP. Nach der Blockierung von DBP konnte in der späten Phase der Infektion eine signifikante Erhöhung der Proteinmengen von viralen LEF-Proteinen beobachtet werden, die jedoch keinen messbaren Effekt auf die Synthese viraler Strukturproteine oder auf die Bildung von Virus-Polyedern hatte. Die Hemmung der postulierten RNA-Polymerase-Untereinheit LEF-4 führte zum Verlust der späten und sehr späten viralen Strukturproteinsynthese und der Virusproduktion. Vergleichsanalysen während der HSV-1-Infektion, in der ausschließlich die Wirts-RNAP II für die virale Transkription genutzt wird, zeigten keinen signifikanten Einfluss auf die Expression von TFIID-Komponenten. In Lokalisierungsstudien konnten die RNAP II und die TFIID-Untereinheiten TBP, TAF1 und TAF4 ab der frühen Phase der Infektion in distinkten Kerndomänen beobachtet werden, die mit Orten der viralen DNA-Synthese kolokalisierten. Die initiale Relokalisierung der basalen Transkriptionsfaktoren in Präreplikationszentren schien unabhängig von replizierender viraler DNA stattzufinden, wohingegen die Größenzunahme der Kernstrukturen in Abhängigkeit von viralen DNA-Replikationszentren geschah. Diese Daten zeigen erstmals eine Zunahme des TBP-Proteins in der späten Baculovirus-Infektionsphase und deuten damit auf eine Beteiligung von TBP an der Hyperexpression der sehr späten viralen Faktoren hin. In einem offenbar konservierten Mechanismus im Infektionsverlauf großer DNA-Viren findet die virale Transkription an Orten der viralen DNA-Synthese durch Rekrutierung von TFIID-Untereinheiten statt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die freigesetzten Virusgenome direkt für die Transkription zugänglich sind, so dass basale Transkriptionsfaktoren in Replikationszentren rekrutiert werden

Nuclear IE2 structures are related to viral DNA replication sites during baculovirus infection

The ie2 gene of Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus is I of the 10 baculovirus genes that have been identified as factors involved in viral DNA replication. IE2 is detectable in the nucleus as one of the major early- expressed proteins and exhibits a dynamic localization pattern during the infection cycle (D. Murges, 1. Quadt, J. Schroer, and D. Knebel-Morsdorf, Exp. Cell Res. 264:219-232, 2001). Here, we investigated whether IE2 localized to regions of viral DNA replication. After viral DNA was labeled with bromode- oxyuridine (BrdU), confocal imaging indicated that defined IE2 domains colocalized with viral DNA replication centers as soon as viral DNA replication was detectable. In addition, a subpopulation of IE2 structures colocalized with two further virus-encoded replication factors, late expression factor 3 (LEF-3) and the DNA binding protein (DBP). While DBP and LEF-3 structures always colocalized and enlarged simultaneously with viral DNA replication sites, only those IE2 structures that colocalized with replication sites also colocalized with DBP. Replication and transcription of DNA viruses in association with promyelocytic leukemia protein (PML) oncogenic domains have been observed. By confocal imaging we demonstrated that the human PML colocalized with IE2. Triple staining revealed PML/IE2 domains in the vicinity of viral DNA replication centers, while IE2 alone colocalized with early replication sites, demonstrating that PML structures do not form common domains with viral DNA replication centers. Thus, we conclude that IE2 colocalizes alternately with PML and the sites of viral DNA replication. Small ubiquitin-like modifier SUMO-1 has been implicated in the nuclear distribution of PML. Similar to what was found for mammalian cells, small ubiquitin-like modifiers were recruited to PML domains in infected insect cells, which suggests that IE2 and PML colocalize in conserved cellular domains. In summary, our results support a model for IE2 as part of various functional sites in the nucleus that are connected with viral DNA replication

Expression of Baculovirus Late and Very Late Genes Depends on LEF-4, a Component of the Viral RNA Polymerase Whose Guanyltransferase Function Is Essential

Baculovirus lef-4 encodes one subunit of the viral RNA polymerase. Here, we demonstrate the essential nature of LEF-4 by RNA interference and bacmid knockout technology. Silencing of LEF-4 in wild-type virus-infected cells suppressed expression of structural genes, while early expression was unaffected, demonstrating its essential role in late gene expression. After transfection of insect cells with lef-4 mutant bacmid, no viral progeny was produced, further defining its central role in infection. Cotransfection with wild-type lef-4 plasmid restored normal replication, but plasmid encoding a guanyltransferase-deficient version failed to rescue. These results emphasize the importance of the mRNA capping function of LEF-4

Expression and nuclear localization of the TATA-box-binding protein during baculovirus infection

The TATA-box-binding protein (TBP) plays a key role in initiating eukaryotic transcription and is used by many viruses for viral transcription. We previously reported increased TBP levels during infection with the baculovirus Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrovirus (AcMNPV). The TBP antiserum used in that study, however, cross-reacted with a baculoviral protein. Here, we reported that increased amounts of nuclear TBP were detected upon infection of Spodoptera frugiperda and TN-368 cells with a TBP-specific antiserum. TBP levels increased until 72 h post-infection (p.i.), whilst tbp transcripts decreased by 16 h p.i., which suggested a virus-induced influence on the TBP protein levels. To address a potential modification of the TBP degradation pathway during infection, we investigated the possible role of viral ubiquitin. Infection studies with AcMNPV recombinants carrying a mutated viral ubiquitin gene revealed that the TBP increase during infection was not altered. In addition, pulse-chase experiments indicated a high TBP half-life of similar to 60 h in uninfected cells, suggesting that a virus-induced increase of TBP stability was unlikely. This increase in TBP correlated with a redistribution to nuclear domains resembling sites of viral DNA synthesis. Furthermore, we observed colocalization of TBP with host RNA polymerase (RNAP) II, but only until 8 h p.i., whilst TBP, but not RNAPII, was present in the enlarged replication domains late during infection. Thus, we suggested that AcMNPV adapted a mechanism to accumulate the highly stable cellular TBP at sites of viral DNA replication and transcription