Raskaudenaikaisen anti-G-vasta-aineen (Rh) erottaminen anti-DC-vasta-aineyhdistelmästä (Rh) absorptioeluaatiomenetelmällä

Sikiö perii veriryhmätekijät molemmilta vanhemmiltaan. Äidin ja sikiön veriryhmätekijöiden poiketessa toisistaan voi äidin immuunijärjestelmä aktivoitua tuottamaan vasta-aineita sikiön isältään perimiä punasolujen pintarakenteita kohtaan. Suurimman osan raskaudenaikaisista immunisaatioista aiheuttaa Rh-vasta-aine anti-D. Se on tärkein vastasyntyneen hemolyyttistä tautia aiheuttava punasoluvasta-aine ja suurimmassa immunisaatioriskissä ovat ne RhD-negatiiviset äidit, jotka synnyttävät RhD-positiivisen lapsen. Koska G-antigeenin tiedetään olevan harvoja poikkeuksia lukuun ottamatta läsnä lähes kaikissa D- ja C-antigeenin suhteen positiivisissa punasoluissa, on sitä vastaan muodostuvan anti-G-vasta-aineen todettu häiritsevän RhD-negatiivisten äitien vasta-ainetunnistuksia. Opinnäytetyön empiirinen osuus toteutettiin Suomen Punaisen Ristin Veripalvelussa, Veriryhmätutkimusten laboratoriossa. Työtä varten oli kerätty potilas- ja neuvolanäytteitä, joista anti-G-vasta-aine erotettiin alloabsorptiomenetelmää käyttäen. Happoeluaatiolla punasolun pintaan kiinnittyneet punasoluvasta-aineet irrotettiin happamaan puskuriin, josta ne osoitettiin vasta-ainetunnistuksella. Vasta-aineet tunnistettiin ID-geelitekniikkaa käyttäen ja vasta-ainepitoisuudet määritettiin titraamalla. Kontrollisolut oli käsitelty papaiinilla. Tavoitteena oli ottaa käyttöön menetelmä, jolla anti-G-vasta-aine voidaan luotettavasti erottaa anti-DC-vasta-aineyhdistelmästä. Oli myös tarpeen selvittää kriteerit, jotka herättivät epäilyn anti-G-vasta-aineesta ja laimeneeko vasta-ainepitoisuus absorptiokäsittelyn aikana. Absorptiolla punasoluvasta-aineet voitiin erottaa toisistaan ja eluaatiolla absorption tulos pys-tyttiin varmistamaan. Kun kyseessä oli anti-G-vasta-aine, tulokset osoittivat että C-positiiviset solut reagoivat D-positiivisia soluja vahvemmin. Vasta-ainepitoisuuksien ei myöskään todettu laimenevan merkittävästi absorption aikana. Johtopäätöksenä vahvojen vasta-aineiden kohdalla todettiin, että absorptiota voidaan tarvittaessa jatkaa, koska sen ei todettu heikentävän merkittävästi vasta-ainepitoisuuksia. Anti-G-vasta-ainetta voidaan epäillä, jos anti-D- ja anti-C-vasta-aineiden osalta todetaan samankaltaiset titterit. Kontrollisoluina tullaan jatkossa käyttämään entsyymillä käsittelemättömiä soluja.The fetus inherits blood group factors from both parents. If maternal and fetal blood group factors diverge, the mothers immune system may be activated to produce antibodies against to fetal red blood cells. Most of the immunization during pregnancy cases are caused by anti-D antibody and mothers who give birth to a RhD-positive child, are at the risk of getting immunization. Since G-antigen is known to be present in almost all the D- and C-positive red blood cells, anti-G antibody has been found to interfere with the antibody detection of a D-negative mothers. I conducted the empirical part of my study at the Blood Group Research Laboratory of the Finnish Red Cross, Blood Service. The samples for this study (n=17) were collected at a Finnish maternity welfare clinic and the patient samples. Anti-G antibody was separated with the alloabsorption method. Using the elution method, antibodies were removed in to an acidic buffer. Antibodies were identified using the ID-gel technique, and antibody concentrations were determined by titration. Control cells were treated with papain. The purpose of my study was to design a method for the separation of anti-G (Rh) antibody from the anti-D (Rh) and anti-C (Rh) antibody combination. It was necessary to establish the criteria, of when an anti-G antibody test should be carried out and if antibody concentration was diluted during an absorption process. The results showed that antibodies might be separated with the absorption method and using elution method, the result might be ensured. The results showed also that when a native sample of antibody concentration was similar to the anti-D and C, anti-G antibody might be present as well. Moreover, it was found that the antibody concentration was not diluted significantly during absorption. The results lead to the conclusion that in the case of a strong antibody, absorption may be extended, if necessary, because the absorption does not significantly weaken antibody levels. In the future, this method may be used for control cells, which have not been treated with enzymes

Identification of mutations and copy number variations in leukemias by Droplet Digital PCR

Background: Translocations cause mutations in a differentiated stem or progenitor cells and trigger leukemia leading to oncogenic genes activating abnormal tyrosine kinase activity. Although tyrosine kinase inhibitors (TKIs) have revolutionized leukemia treatment, some patients develop resistance. The mechanism of resistance remains unclear, though mutations are known to contribute to its development The common inducer of resistance is a point mutation in the coding region of a kinase-expressing gene. The highly resistant p.Thr315Ile gatekeeper mutation confers resistance to all 1st and 2nd-generation tyrosine kinase inhibitors. The mutation is located in the BCR::ABL1 kinase domain and abrogates the selective binding. The therapeutic response to TKIs can also be predicted using cancer biomarkers. The tumor suppressor gene CDKN2A is located on chromosome 9p21. Deletion in this region is known to cause cell proliferation and dysregulation of proapoptotic pathways. Similarly, the lymphoid transcription factor IKZF1 appears to be associated with a poorer TKI response, especially in children. In contrast, adult outcomes have been conflicting. IKZF1 is located on chromosome 7p12.2, and the effects of region deletions have been linked to signaling pathways that modulate the therapeutic response. Detection of biomarkers requires effective methods to assess the risk of leukemia better. Although routine methods of cancer genetics are workable, they are also laborious and expensive. Despite tremendous progress in understanding leukemia, the ever-increasing number of cases encourages searching for novel ways for molecular monitoring. New technologies such as Droplet Digital PCR (ddPCR) have attracted great interest in detecting rare mutations and copy number variations. Aims: The study aimed to determine the accuracy of ddPCR for detecting a rare p.Thr315Ile mutation and copy number variations in the CDKN2A and IKZF1 genes. Methods: Assays were performed by the ddPCR method with commercial probes that recognize the target gene. The target gene was determined by fractionating the sample into 20,000 droplets. Droplets were generated using a Bio-Rad QX200TMDroplet Generator. Each droplet of template molecule undergoes separate PCR amplification. The target sequence was amplified on an Applied BioSystems GeneAmp 9700 PCR System, and the reaction products were read on a BioRad QX100TMDroplet Reader. Finally, the results were analyzed with QuantaSoftTMSoftware. Results: A total of 31 samples were analyzed in the study. The results of copy number variations correlated well with previous clinical data. The main finding was that the method efficiently detects the target gene from a small amount of DNA sample without time-consuming sample processing. With the Thr315 probe, the results were not consistent with the previous results of the samples. Conclusion: The ability of the ddPCR method to accurately determine the concentrations of replicating targets makes it a promising platform for measuring copy numbers of genomic biomarkers. By optimizing T315l mutation measurement, the method may provide a valuable tool in the future for diagnosing early leukemia, evaluating treatment response and predicting disease prognosisTutkimuksen tausta: Translokaatiot aiheuttavat mutaatioita hematopoieesin monikykyisissä kantasoluissa ja varhaisissa progenitorisoluissa. Translokaatiot voivat laukaista syövän häiritsemällä normaalien geenien toimintaa tai muodostamalla syövälle altistavia onkogeeneja, jotka aktivoivat epänormaalia tyrosiinikinaasiaktiivisuutta. Vaikka tyrosiinikinaasin estäjät (TKE) ovat mullistaneet leukemian hoidon, osalle potilaista kehittyy resistenssi. Resistenssin mekanismi on edelleen epäselvä, joskin mutaatioiden tiedetään edistävän sen kehittymistä. Tunnetuin resistenssin aikaansaaja on pistemutaatio kinaasia ilmentävän geenin koodaavalla alueella. Erittäin vastustuskykyinen p.Thr315Ile portinvartija mutaatio aiheuttaa resistenssin kaikille 1. ja 2. sukupolven tyrosiinikinaasin estäjille. Mutaatio sijaitsee BCR::ABL1-kinaasidomeenissa ja kumoaa lääkkeen selektiivisen sitoutumisen. TKE:n hoitovastetta voidaan ennustaa myös molekyylibiomarkkereilla. Yksi niistä on kasvainsupressorigeeni CDKN2A, joka sijaitsee kromosomissa 9p21. Geenin deleetiota seuraa solujen proliferaatio ja proapoptoottisten reittien dysregulaatio. Samoin lymfaattinen transkriptiotekijä IKZF1 näyttää liittyvän huonompaan TKE-vasteeseen, erityisesti lapsilla. Sen sijaan aikuisten tulokset ovat olleet ristiriitaisia. IKZF1 sijaitsee kromosomissa 7p12.2 ja alueen deleetiot vaikuttavat signalointireitteihin moduloiden terapeuttista vastetta. Näiden biomarkkereiden havaitseminen edellyttää tehokkaita menetelmiä, jotka mahdollistavat leukemian paremman riskinarvion. Vaikka syöpägenetiikan rutiinimenetelmät ovat toimivia, ne ovat myös työläitä ja kalliita. Huolimatta valtavasta edistymisestä leukemian ymmärtämisessä, jatkuvasti kasvava tapausten määrä rohkaisee etsimään uusia tapoja molekyyliseurantaan. Nousevat teknologiat, kuten Droplet Digital PCR (ddPCR), ovat herättäneet suurta kiinnostusta harvinaisten mutaatioiden ja kopiolukuvaihteluiden havaitsemiseen. Tavoitteet: Tutkimuksen päätavoitteena oli arvioida ddPCR-menetelmän tarkkuutta p.Thr315Ile mutaation sekä CDKN2A- ja IKZF1-geenien kopiolukuvaihteluiden havaitsemisessa. Menetelmät: Määritykset tehtiin ddPCR-menetelmällä kohdegeenin tunnistavalla kaupallisella koettimella. Ensin kohdegeeni fraktioitiin 20 000 pisaraksi. Pisaroiden luomiseen käytettiin BioRad QX200TMDroplet Generator -laitetta. Templaattimolekyylien PCR-monistus tapahtuu jokaisessa yksittäisessä pisarassa. Kohdesekvenssi monistettiin Applied BioSystems GeneAmp 9700 PCR:llä ja reaktiotuotteet luettiin Bio-Rad QX100TMDroplet Reader -laitteella. Lopuksi tulokset analysoitiin QuantaSoftTM ohjelmistolla. Tulokset: Kaiken kaikkiaan tutkimuksessa analysoitiin yhteensä 31 näytettä. Kopioiden lukumäärän vaihtelun tulokset korreloivat hyvin aikaisempien kliinisten tietojen kanssa. Päähavainto oli, että menetelmä havaitsee kohdegeenin tehokkaasti pienestä määrästä DNA-näytettä ilman aikaa vievää näytteenkäsittelyä. Thr315-koettimella tulokset eivät olleet yhdenmukaisia näytteiden aikaisempien tulosten kanssa. Johtopäätös: ddPCR-menetelmän kyky määrittää tarkasti replikoituvien kohteiden pitoisuudet, tekee siitä lupaavan alustan genomisten biomarkkerien kopiomäärän määrittämiseen. Optimoimalla T315l-mutaatiomääritystä, menetelmä voi tarjota tulevaisuudessa arvokkaan työkalun hoitovasteen ja sairauden ennusteen arvioimiseen