Diversidad de los sistemas de adquisición de hierro mediante sideróforos en Photobacterium damselae subsp. damselae

Photobacterium damselae subsp. damselae es una bacteria Gram-negativa, de la familia Vibrionaceae, que causa un tipo de vibriosis en una amplia variedad de especies marinas, y puede afectar también a animales homeotermos. El hierro desempeña un papel fundamental en el metabolismo y la virulencia de esta bacteria, pero los mecanismos que utiliza para su adquisición, y especialmente los basados en la síntesis de sideróforos, son todavía en gran medida desconocidos. Por tanto, en este trabajo nos propusimos como objetivo principal desentrañar la base genética de la síntesis y transporte de sideróforos en esta bacteria, así como aportar los datos biológicos necesarios para la determinación de su naturaleza química. Los resultados obtenidos indican que en P. damselae subsp. damselae existe una variabilidad entre las diferentes cepas con respecto a la capacidad de crecimiento en déficit de hierro, pudiendo clasificarlas, de mayor a menor capacidad de crecimiento y producción de sideróforos, en tres grupos: tipo A, tipo B y tipo C. El trabajo descrito en esta memoria permite explicar este comportamiento en base a diferentes mecanismos de adquisición de hierro, basados en sideróforos. Así, mediante estudios de proteómica y secuenciación de ADN demostramos que las cepas de tipo A han adquirido por transferencia horizontal una isla genómica que contiene todos los genes de síntesis y transporte del sideróforo vibrioferrina organizados en dos operones: pvsABCDE (síntesis) y psuA-pvuABCDE (transporte). Los análisis químicos y los bioensayos realizados demuestran que estos genes son activos y que la vibrioferrina está presente en los cultivos de las cepas de tipo A. Sin embargo, los experimentos de mutagénesis demuestran que cuando se interrumpe la síntesis de vibrioferrina (por mutación del gen pvsD) la cepa mutante mantiene, aunque en menor medida, la capacidad de crecer en condiciones de limitación de hierro y de producir sideróforos, mostrando valores equivalentes a los de las cepas de tipo B. Todo ello sugiere que las cepas tipo A sintetizan dos sideróforos, la vibrioferrina y un segundo sideróforo común con las cepas tipo B. Para identificar la base genética de este sideróforo común se han seguido diferentes estrategias: búsquedas in silico de posibles genes relacionados con la síntesis y transporte de sideróforos, genómica comparada de los tres tipos de cepas y mutagénesis por transposición. Con ninguna de estas estrategias se ha logrado identificar de forma concluyente las secuencias génicas que podrían codificar este sistema de adquisición de hierro, por lo que se dedujo que probablemente los genes biosintéticos estarían relacionados con la síntesis de metabolitos esenciales, y que pasarían por tanto desapercibidos en las estrategias de búsqueda utilizadas. Puesto que todas las cepas pudieron utilizar citrato férrico como única fuente de hierro y que se demostró que tanto las cepas de tipo B, como el mutante de las de tipo A deficientes en la síntesis de vibrioferrina, acumulan una notable cantidad de citrato en el medio cuando crecen en déficit de hierro, se llegó a la conclusión de que probablemente el citrato, o una molécula que lo contenga, sea el sideróforo común a todas las cepas. Esta hipótesis viene apoyada por el hecho de que en las cepas de tipo A se reprime la acumulación de citrato cuando sintetizan vibrioferrina, y porque se logró demostrar la presencia de citrato en una fracción activa procedente de cultivos en déficit de hierro. Los resultados de infecciones experimentales indican que la síntesis de vibrioferrina no parece proporcionar una mayor virulencia para rodaballo a las cepas tipo A. Posiblemente la adquisición de este sistema de asimilación de hierro podría proporcionar otras ventajas de tipo ecológico. Así, las cepas de tipo A sintetizarían el sideróforo común basado en citrato cuando se encuentran dentro del hospedador y, en cambio, sintetizarían vibrioferrina de forma preferente cuando se encuentran compartiendo nichos marinos con otros vibrios

Secreted citrate serves as iron carrier for the marine pathogen photobacterium damselae subsp damselae

Photobacterium damselae subsp damselae (Pdd) is a Vibrionaceae that has a wide pathogenic potential against many marine animals and also against humans. Some strains of this bacterium acquire iron through the siderophore vibrioferrin. However, there are virulent strains that do not produce vibrioferrin, but they still give a strong positive reaction in the CAS test for siderophore production. In an in silico search on the genome sequences of this type of strains we could not find any ORF which could be related to a siderophore system. To identify genes that could encode a siderophore-mediated iron acquisition system we used a mini-Tn10 transposon random mutagenesis approach. From more than 1,400 mutants examined, we could isolate a mutant (BP53) that showed a strong CAS reaction independently of the iron levels of the medium. In this mutant the transposon was inserted into the idh gene, which encodes an isocitrate dehydrogenase that participates in the tricarboxylic acid cycle. The mutant did not show any growth impairment in rich or minimal media, but it accumulated a noticeable amount of citrate (around 7 mM) in the culture medium, irrespective of the iron levels. The parental strain accumulated citrate, but in an iron-regulated fashion, being citrate levels 5–6 times higher under iron restricted conditions. In addition, a null mutant deficient in citrate synthase showed an impairment for growth at high concentrations of iron chelators, and showed almost no reaction in the CAS test. Chemical analysis by liquid chromatography of the iron-restricted culture supernatants resulted in a CAS-positive fraction with biological activity as siderophore. HPLC purification of that fraction yielded a pure compound which was identified as citrate from its MS and NMR spectral data. Although the production of another citrate-based compound with siderophore activity cannot be ruled out, our results suggest that Pdd secretes endogenous citrate and use it for iron scavenging from the cell environmentThis work was supported by grants AGL2012-39274-C02-01/02 and AGL2015-63740-C2-1/2-R (AEI/FEDER, EU) from the State Agency for Research (AEI) of Spain, and co-funded by the FEDER Programme from the European Union. The support of Xunta de Galicia (Spain) with grant GRC-2014/007 is also acknowledgedS