ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНАНТИОМЕРНОЙ ЧИСТОТЫ ПЕМЕТРЕКСИДА НА СОРБЕНТАХ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ МАКРОЦИКЛИЧЕСКИМИ АНТИБИОТИКАМИ

The enantioseparation of Pemetrexed on chiral sorbents with macrocyclic glycopeptide antibiotics as chiral selectors was investigated. The pharmacological group of Pemetrexed is antimetabolites with antitumor activity. Pemetrexed is a structural analog of folic acid. IUPAC name of this drug is disodium (2S)-2-[[4-[2-(2-amino-4-oxo-4,7-dihydro-1H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl)ethyl]benzoyl]amino]pentanedioate heptahydrate. The mechanism of Pemetrexed antitumor action is based on the inhibition of the synthesis of purine and pyrimidine. Chiral stationary phases with antibiotics of different structures were used. Columns with silica modified antibiotic eremomycin (commercial column Nautilus-E, Bio-Chem-Mac, Russia) and silica with teicoplanin aglycone (ChirobioticTAG, Astec, USA) were applied. The separation of the enantiomers was carried out by the reversed-phase and polar-ion chromatography modes.  The mobile phase in the reversed-phase chromatography mode was a mixture of ammonium dihydrogenphosphate solution and organic solvents (methanol, acetonitrile), and in polar-ion mode – organic solvents (methanol, acetonitrile) with additives of acids (acetic acid, formic acid) and bases (triethylamine, diethylamine). The influence of the components’ nature and concentration in the mobile phase, their composition and pH on the separation of Pemetrexed enantiomers was investigated using the silica modified eremomycin and teicoplanin aglycone. The resolution of Pemetrexed enantiomers was 2.8 - 3.3 in the reverse phase mode on the column with eremomycin. In the polar-ion mode chromatography, Pemetrexed eluted with dead volume (capacity factor k` = 0.1 ÷ 0.3) independently of the additives concentrations in the mobile phase. The enantiomers of Pemetrexed were not separated on the column with teicoplanin aglycone. Teicoplanin aglycone has one amino-group only, whereas eremomycin has three amino-groups. Electrostatic interactions between teicoplanin aglycone and Pemetrexed were less than interactions between eremomycin and Pemetrexed. Eremomycin has more chiral centers than teicoplanin aglycone. In addition, hydrophobic interactions, hydrogen bonds and dipolar interactions with amide and hydroxyl groups of eremomycin provide high enantioselectivity of sorbent with eremomycin. The determination of enantiomeric purity of Pemetrexed drug on the column with eremomycin was conducted.  Mobile phase was (55:15:30) MeOH:ACN:NH4H2PO4 (50mM, pH = 2.5). The time of analysis was less than 10 minutes. D-isomer was not detected in the drug. The limit of detection of Pemetrexed D-enantiomer was 0.0003 mg/ml (assumed 3:1 signal to noise ratio) which constituted 0.12 % from the total amount drug.Keywords: macrocyclic glucopeptides, chiral selector, enantiomers, enantiomeric purity of the pharmaceutical substances(Russian)DOI: http://dx.doi.org/10.15826/analitika.2016.20.2.002 E.N. Shapovalova, I.A. Fedorova, A.A. Priporova, I.A. Ananieva, O.A. ShpigunM.V.Lomonosov Moscow State University, 1-3 Leninskie gory,  Moscow, ,  119991, Russian FederationИсследовано энантиоразделение пеметрекседа на сорбентах с иммобилизованными на поверхности силикагеля макроциклическими гликопептидными антибиотиками. Пеметрексед относится к фармакологической группе антиметаболидов, обладающих противоопухолевой активностью; структурный аналог фолиевой кислоты. Систематическое (ИЮПАК) наименование динатриевая соль (2S)-2-[[4-[2-(2-амино-4-оксо-4,7-дигидро-1H-пиррол[2,3-d]пиримидин-5-ил)этил]бензоил]-глутаминовой кислоты гептагидрат, действующее вещество ‒ L-изомер пеметрекседа. Механизм противоопухолевого действия пеметрекседа обусловлен ингибированием синтеза пуринов и пиримидинов. Для того чтобы выявить, как влияет структура антибиотика, взятого в качестве хирального селектора, на энантиоразделение веществ, для разделения энантиомеров использовали неподвижные фазы с отличающимися по своей структуре антибиотиками ‒ эремомицином (коммерческая колонка Nautilus-E (ЗАО «Био-Хим-Мак», Россия)) и агликоном тейкопланина (ChirobioticTAG (Astec, США)). Разделение энантиомеров проводили в обращенно-фазовом и полярно-ионном режимах хроматографии. Для разделения энантиомеров в обращенно-фазовом режиме хроматографии в качестве подвижной фазы использовали смесь раствора дигидрофосфата аммония (NH4H2PO4) и органических растворителей – метанол (MeOH), ацетонитрил (ACN), в полярно-ионном режиме – органические растворители (метанол, ацетонитрил) с добавками кислот (ледяная уксусная кислота и муравьиная кислота) и оснований (триэтиламин и диэтиламин). Исследовали влияние природы и концентрации компонентов подвижной фазы, ее состава и pH на разделение энантиомеров пеметрекседа на силикагеле, модифицированном эремомицином и агликоном тейкопланина. Энантиомеры пеметрекседа удалось разделить с разрешением 2.8-3.3 на колонке Nautilus-E в обращенно-фазовом режиме. Полярно-ионный режим хроматографии не дал положительных результатов, разделить энатиомеры не удалось: пеметрексед практически не удерживался на колонке (значение фактора удерживания k` = 0.1 ÷ 0.3) независимо от концентрации добавки кислоты и амина в подвижную фазу. Проведенные исследования энантиоразделения пеметрекседа на сорбенте с агликоном тейкопланина в обращенно-фазовом и полярно-ионном режимах хроматографии показали, что энантиомеры пеметрекседа невозможно разделить с данным селектором. Агликон тейкопланина содержит только одну аминогруппу, по сравнению с тремя у эремомицина, что уменьшает электростатические взаимодействия между макроциклическим антибиотиком и пеметрекседом, и на сорбенте, модифицированным агликоном тейкопланина, он удерживается слабо. Эремомицин содержит значительно больше хиральных центров по сравнению с агликоном тейкопланина Кроме того, лучшая селективность разделения энантиомеров реализуется за счет образования водородных связей и дипольных взаимодействий с амидными и гидроксильными группами эремомицина и за счет гидрофобных взаимодействий. Показана возможность определения энантиомерной чистоты фармацевтического препарата на колонке Nautilus-E при элюировании подвижной фазой: (55 : 15 : 30) % об. MeOH : ACN : NH4H2PO4 (50 мM, pH = 2.5), время анализа составляет меньше 10 минут, D-изомер не обнаружен. Предел обнаружения соединения, оцененный по отношению сигнал/фон = 3 : 1 составил 0.0003 мг/мл, что соответствует 0.12 % мас. D-формы по отношению к общему количеству препарата.         Ключевые слова: макроциклические гликопептидные антибиотики, хиральные селекторы, энантиомеры, оптическая чистота лекарственных формDOI: http://dx.doi.org/10.15826/analitika.2016.20.2.00

Determination of the enantiomeric purity of Pemetrexed on the macrocyclic glycopeptides bonded phases

Исследовано энантиоразделение пеметрекседа на сорбентах с иммобилизованными на поверхности силикагеля макроциклическими гликопептидными антибиотиками. Пеметрексед относится к фармакологической группе антиметаболидов, обладающих противоопухолевой активностью; структурный аналог фолиевой кислоты. Систематическое (ИЮПАК) наименование динатриевая соль (2S)-2-[[4-[2-(2-амино-4-оксо-4,7-дигидро-1H-пиррол[2,3-d]пиримидин-5-ил)этил]бензоил]-глутаминовой кислоты гептагидрат, действующее вещество - L-изомер пеметрекседа. Механизм противоопухолевого действия пеметрекседа обусловлен ингибированием синтеза пуринов и пиримидинов. Для того чтобы выявить, как влияет структура антибиотика, взятого в качестве хирального селектора, на энантиоразделение веществ, для разделения энантиомеров использовали неподвижные фазы с отличающимися по своей структуре антибиотиками - эремомицином (коммерческая колонка Nautilus-E (ЗАО «Био-Хим-Мак», Россия)) и агликоном тейкопланина (ChirobioticTAG (Astec, США)). Разделение энантиомеров проводили в обращенно-фазовом и полярно-ионном режимах хроматографии. Для разделения энантиомеров в обращенно-фазовом режиме хроматографии в качестве подвижной фазы использовали смесь раствора дигидрофосфата аммония (NH₄H₂PO₄) и органических растворителей - метанол (MeOH), ацетонитрил (ACN), в полярно-ионном режиме - органические растворители (метанол, ацетонитрил) с добавками кислот (ледяная уксусная кислота и муравьиная кислота) и оснований (триэтиламин и диэтиламин). Исследовали влияние природы и концентрации компонентов подвижной фазы, ее состава и pH на разделение энантиомеров пеметрекседа на силикагеле, модифицированном эремомицином и агликоном тейкопланина. Энантиомеры пеметрекседа удалось разделить с разрешением 2.8-3.3 на колонке Nautilus-E в обращенно-фазовом режиме. Полярно-ионный режим хроматографии не дал положительных результатов, разделить энатиомеры не удалось: пеметрексед практически не удерживался на колонке (значение фактора удерживания k` = 0.1 ÷ 0.3) независимо от концентрации добавки кислоты и амина в подвижную фазу. Проведенные исследования энантиоразделения пеметрекседа на сорбенте с агликоном тейкопланина в обращенно-фазовом и полярно-ионном режимах хроматографии показали, что энантиомеры пеметрекседа невозможно разделить с данным селектором. Агликон тейкопланина содержит только одну аминогруппу, по сравнению с тремя у эремомицина, что уменьшает электростатические взаимодействия между макроциклическим антибиотиком и пеметрекседом, и на сорбенте, модифицированным агликоном тейкопланина, он удерживается слабо. Эремомицин содержит значительно больше хиральных центров по сравнению с агликоном тейкопланина Кроме того, лучшая селективность разделения энантиомеров реализуется за счет образования водородных связей и дипольных взаимодействий с амидными и гидроксильными группами эремомицина и за счет гидрофобных взаимодействий. Показана возможность определения энантиомерной чистоты фармацевтического препарата на колонке Nautilus-E при элюировании подвижной фазой: (55 : 15 : 30) % об. MeOH : ACN : NH₄H₂PO₄ (50 мM, pH = 2.5), время анализа составляет меньше 10 минут, D-изомер не обнаружен. Предел обнаружения соединения, оцененный по отношению сигнал/фон = 3 : 1 составил 0.0003 мг/мл, что соответствует 0.12 % мас. D-формы по отношению к общему количеству препарата.The enantioseparation of Pemetrexed on chiral sorbents with macrocyclic glycopeptide antibiotics as chiral selectors was investigated. The pharmacological group of Pemetrexed is antimetabolites with antitumor activity. Pemetrexed is a structural analog of folic acid. IUPAC name of this drug is disodium (2 S )-2-[[4-[2-(2-amino-4-oxo-4,7-dihydro-1 H -pyrrolo[2,3- d ]pyrimidin-5-yl)ethyl]benzoyl]amino]pentanedioate heptahydrate. The mechanism of Pemetrexed antitumor action is based on the inhibition of the synthesis of purine and pyrimidine. Chiral stationary phases with antibiotics of different structures were used. Columns with silica modified antibiotic eremomycin (commercial column Nautilus-E, Bio-Chem-Mac, Russia) and silica with teicoplanin aglycone (ChirobioticTAG, Astec, USA) were applied. The separation of the enantiomers was carried out by the reversed-phase and polar-ion chromatography modes. The mobile phase in the reversed-phase chromatography mode was a mixture of ammonium dihydrogenphosphate solution and organic solvents (methanol, acetonitrile), and in polar-ion mode - organic solvents (methanol, acetonitrile) with additives of acids (acetic acid, formic acid) and bases (triethylamine, diethylamine). The influence of the components’ nature and concentration in the mobile phase, their composition and pH on the separation of Pemetrexed enantiomers was investigated using the silica modified eremomycin and teicoplanin aglycone. The resolution of Pemetrexed enantiomers was 2.8 - 3.3 in the reverse phase mode on the column with eremomycin. In the polar-ion mode chromatography, Pemetrexed eluted with dead volume (capacity factor k ` = 0.1 ÷ 0.3) independently of the additives concentrations in the mobile phase. The enantiomers of Pemetrexed were not separated on the column with teicoplanin aglycone. Teicoplanin aglycone has one amino-group only, whereas eremomycin has three amino-groups. Electrostatic interactions between teicoplanin aglycone and Pemetrexed were less than interactions between eremomycin and Pemetrexed. Eremomycin has more chiral centers than teicoplanin aglycone. In addition, hydrophobic interactions, hydrogen bonds and dipolar interactions with amide and hydroxyl groups of eremomycin provide high enantioselectivity of sorbent with eremomycin. The determination of enantiomeric purity of Pemetrexed drug on the column with eremomycin was conducted. Mobile phase was (55:15:30) MeOH:ACN:NH₄H₂PO₄ (50mM, pH = 2.5). The time of analysis was less than 10 minutes. D-isomer was not detected in the drug. The limit of detection of Pemetrexed D-enantiomer was 0.0003 mg/ml (assumed 3:1 signal to noise ratio) which constituted 0.12 % from the total amount drug.This work was supported by RFBR No15-03-05979a

Высокотехнологичные методы в диагностике рака гортани: клинический случай

Summary. The article observes the possibilities of high-technologic radiologic methods for diagnostics of laryngeal malignancy. Despite of large amount of publications, dedicated to the question of different radiologic imaging modalities application for laryngeal tumors the aspects of complex radiological examination and highly differentiated laryngeal tumors detection are not well described.Materials and methods. In our article there is the case of diagnostic process in 56-years old male patient complained on voice changes with the right vocal fold neoplasm detected in laryngeal videoendoscopy, which had ambiguous pattern in autofluorescence. The results of laryngeal videoendoscopy included differently colored zones from white ones, which corresponded to benign tissue, to blue and violet ones, which corresponded to malignancy. The patient was examined with contrast-enhanced computed tomography, contrast-enhanced magnetic resonance imaging with diffusion-weighted protocol and combined positron-emission and computed tomography with 18F-fluorodeoxyglucose.Results. Computed tomography data showed the right vocal fold thickening without contrast agent uptake, on magnetic resonance images there was detected the irregular thickening of the same fold, also without contrast medium agent uptake. In positron-emission and computed tomography with 18F-fluorodeoxyglucose a focal radiotracer hypermetabolism with highly increased standard uptake value was detected, which indicated malignancy. In addition distant metastases in thoracic lymph nodes were found. Pathomorphologic diagnosis of high-differentiated laryngeal cancer was established.Discussion. Highly differentiated laryngeal malignant tumors can imitate benign process on computed tomography and magnetic resonance imaging because of peculiar cell composition, but they are characterized with 18F-fluorodeoxyglucose hyperfixation conditioned by glycolytical activity of malignant cells. Negative computed tomography and magnetic resonance imaging data in combination with positive positron-emission and computed tomography results may correspond to highly differentiated laryngeal tumor.Введение. В статье рассматривается возможность использования высокотехнологичных методов лучевой диагностики при наличии онкологического процесса в гортани. Несмотря на большое количество работ в данной области по использованию отдельных лучевых методов исследования, применение комплексной лучевой диагностики и проблема выявления высокодифференцированных опухолей в современной литературе не освещены.Материалы и методы. Ниже приводится клинический случай диагностического поиска у 56-летнего мужчины, предъявлявшего жалобы на изменение голоса, у которого при видеоэндоскопии гортани было выявлено образование правой голосовой складки со «спорной» аутофлюоресценцией: от белых участков, говорящих о доброкачественности процесса, до зон сине-фиолетового цвета, свидетельствующих о злокачественности. Пациенту было проведено комплексное лучевое обследование, включавшее компьютерную томографию с внутривенным контрастным усилением, магнитно-резонансную томографию с протоколом диффузионного взвешивания и совмещенную позитронно-эмиссионную и компьютерную томографию с 18F-фтордезоксиглюкозой.Результаты. При компьютерной томографии отмечалось утолщение правой голосовой связки без накопления контрастного вещества. При магнитно-резонансной томографии также отмечалось неравномерное утолщение правой голосовой складки без накопления контрастного вещества в ней и без признаков ограничения диффузии на диффузионно-взвешенных изображениях. При выполнении совмещенной позитронно-эмиссионной и компьютерной томографии с 18F -фтордезоксиглюкозой в образовании отмечался участок гиперметаболизма радиоафармпрепарата со значительно повышенным значением стандартизованного уровня захвата, свидетельствовавшим о злокачественности процесса. Кроме того, были выявлены отдаленные метастазы во внутригрудные лимфатические узлы. При гистологической верификации был установлен диагноз высокодифференцированного рака гортани.Обсуждение. Высокодифференцированные злокачественные опухоли гортани вследствие особенностей клеточного строения могут имитировать доброкачественный процесс при компьютерной и магнитно-резонансной томографии, однако характеризуются высоким уровнем фиксации 18F-фтордезоксиглюкозы вследствие наличия гликолитической активности злокачественных клеток. Сочетание отрицательных результатов компьютерной и магнитно-резонансной томографии и положительных — совмещенной позитронно-эмиссионной и компьютерной томографии с 18F-фтордезоксиглюко-зой указывает на наличие высокодифференцированной опухоли гортани.</p