Estudio comparativo de los efectos cito- y genotóxicos en células de mamífero con diferente capacidad de reparación del daño genético, en dos modelos de exposición a dosis bajas de radiación ionizante

La presente tesis se enmarca dentro de una disciplina relativamente nueva y creciente, la genética toxicológica, la cual tiene sus fundamentos en dos grandes áreas del conocimiento como son la genética y la toxicología. En este contexto, la radiación constituye en la actualidad un agente genotóxico físico ampliamente estudiado, debido a su creciente utilización en diversos campos de aplicación y el interés por evitar sus consecuencias perjudiciales para la salud humana. La radiación es una forma de energía en movimiento a través del espacio. Según su capacidad para generar pares electrónicos, se clasifica en ionizante y no ionizante. Así, la radiación ionizante se define como cualquier tipo de radiación que sea capaz de remover un electrón de la órbita de un átomo, provocando que el mismo resulte en una forma cargada o ionizada, entre las cuales se encuentran los rayos X. Otra forma de clasificar las radiaciones es en función de su dosis. De esta manera, se plantea que entre el background natural (aproximadamente 0,01 mSv/día) de radiación ionizante y las dosis altas de radiación (aproximadamente 150 mSv), en las que se advierten efectos inmediatos en la salud humana, se encuentra el rango de exposición conocido como dosis bajas de radiación. Este tipo de dosis carece de efectos detectables inmediatamente después de la exposición, sin embargo existe un gran interés en sus consecuencias biológicas a largo plazo. Poco tiempo después de que fueran descubiertas las radiaciones ionizantes, surgió una nueva disciplina que se encarga de estudiar, describir y explicar los efectos que la radiación ionizante tiene sobre los tejidos vivos: la radiobiología. Ésta en sus comienzos, planteó un modelo lineal sin umbral, en el cual se considera que existe una relación lineal entre la dosis de radiación y su efecto sobre el material biológico. Así, los efectos celulares esperados en el rango de las dosis bajas de radiación eran extrapolados linealmente desde las dosis altas. Con el avance de los conocimientos, este paradigma ha ido cambiando debido a que se ha acumulado mucha evidencia que sugiere que los riesgos asociados a dosis bajas de radiación no son los esperados conforme a este modelo. Actualmente, se considera que uno de los principales efectos responsables de que este modelo no se cumpla es la inestabilidad genómica inducida por la radiación. Ésta es definida como el fenómeno por el cual las señales generadas por la exposición a radiación son transmitidas hacia la progenie de las células irradiadas conduciendo a la aparición de efectos genéticos, tales como mutaciones y aberraciones cromosómicas, varias generaciones celulares después de la irradiación original. Entre las lesiones producidas en el ADN por exposición a radiación ionizante, las rupturas de cadena doble son las más riesgosas para la salud humana, por poseer una alta correlación con los procesos de mutagénesis y carcinogénesis. En eucariotas superiores, se reconocen dos mecanismos para la reparación de dichas rupturas, la recombinación homóloga y la reunión de extremos no homólogos. Éste último mecanismo, es el que representa la principal vía por la cual las células reparan las lesiones originadas por radiación ionizante. Por otra parte, los sistemas vivos cuentan con diversos mecanismos de muerte celular, algunos de los cuales se disparan en forma controlada y son verdaderos procesos de muerte tal como la apoptosis, mientras que otros se desarrollan en forma descontrolada o más abruptamente tal como la necrosis.Facultad de Ciencias Naturales y Muse

Estudio comparativo de los efectos cito- y genotóxicos en células de mamífero con diferente capacidad de reparación del daño genético, en dos modelos de exposición a dosis bajas de radiación ionizante

La presente tesis se enmarca dentro de una disciplina relativamente nueva y creciente, la genética toxicológica, la cual tiene sus fundamentos en dos grandes áreas del conocimiento como son la genética y la toxicología. En este contexto, la radiación constituye en la actualidad un agente genotóxico físico ampliamente estudiado, debido a su creciente utilización en diversos campos de aplicación y el interés por evitar sus consecuencias perjudiciales para la salud humana. La radiación es una forma de energía en movimiento a través del espacio. Según su capacidad para generar pares electrónicos, se clasifica en ionizante y no ionizante. Así, la radiación ionizante se define como cualquier tipo de radiación que sea capaz de remover un electrón de la órbita de un átomo, provocando que el mismo resulte en una forma cargada o ionizada, entre las cuales se encuentran los rayos X. Otra forma de clasificar las radiaciones es en función de su dosis. De esta manera, se plantea que entre el background natural (aproximadamente 0,01 mSv/día) de radiación ionizante y las dosis altas de radiación (aproximadamente 150 mSv), en las que se advierten efectos inmediatos en la salud humana, se encuentra el rango de exposición conocido como dosis bajas de radiación. Este tipo de dosis carece de efectos detectables inmediatamente después de la exposición, sin embargo existe un gran interés en sus consecuencias biológicas a largo plazo. Poco tiempo después de que fueran descubiertas las radiaciones ionizantes, surgió una nueva disciplina que se encarga de estudiar, describir y explicar los efectos que la radiación ionizante tiene sobre los tejidos vivos: la radiobiología. Ésta en sus comienzos, planteó un modelo lineal sin umbral, en el cual se considera que existe una relación lineal entre la dosis de radiación y su efecto sobre el material biológico. Así, los efectos celulares esperados en el rango de las dosis bajas de radiación eran extrapolados linealmente desde las dosis altas. Con el avance de los conocimientos, este paradigma ha ido cambiando debido a que se ha acumulado mucha evidencia que sugiere que los riesgos asociados a dosis bajas de radiación no son los esperados conforme a este modelo. Actualmente, se considera que uno de los principales efectos responsables de que este modelo no se cumpla es la inestabilidad genómica inducida por la radiación. Ésta es definida como el fenómeno por el cual las señales generadas por la exposición a radiación son transmitidas hacia la progenie de las células irradiadas conduciendo a la aparición de efectos genéticos, tales como mutaciones y aberraciones cromosómicas, varias generaciones celulares después de la irradiación original. Entre las lesiones producidas en el ADN por exposición a radiación ionizante, las rupturas de cadena doble son las más riesgosas para la salud humana, por poseer una alta correlación con los procesos de mutagénesis y carcinogénesis. En eucariotas superiores, se reconocen dos mecanismos para la reparación de dichas rupturas, la recombinación homóloga y la reunión de extremos no homólogos. Éste último mecanismo, es el que representa la principal vía por la cual las células reparan las lesiones originadas por radiación ionizante. Por otra parte, los sistemas vivos cuentan con diversos mecanismos de muerte celular, algunos de los cuales se disparan en forma controlada y son verdaderos procesos de muerte tal como la apoptosis, mientras que otros se desarrollan en forma descontrolada o más abruptamente tal como la necrosis.Facultad de Ciencias Naturales y Muse

In vitro approach to the study of chronic exposure to low doses of x-rays

El presente trabajo fue realizado con el fin de estudiar el efecto de dosis bajas y repetidas de radiación sobre dos líneas celulares de la misma especie. Se desarrolló un modelo in vitro para evitar la influencia de los factores de confusión que afectan a los estudios epidemiológicos y para simular una exposición crónica. Las técnicas utilizadas fueron el ensayo cometa y el análisis de apoptosis temprana; estas se llevaron a cabo inmediatamente después de la exposición y luego de la irradiación crónica. La irradiación secuencial indujo un aumento de células con daño en el ADN. El índice de daño fue mayor que el de los controles en ambas líneas celulares, tanto inmediatamente después de la exposición como luego de la irradiación crónica. Este aumento fue estadísticamente significativo solamente para la línea celular transformada luego de la irradiación crónica (p<0,001). El análisis de apoptosis arrojó niveles significativamente mayores al control para ambas líneas celulares luego de la exposición crónica (p<0.001). Se demostró que la exposición crónica a radiación ionizante de dosis bajas indujo daño en el ADN y apoptosis en células de hámster chino cultivadas in vitro. Las respuestas de ambos tipos celulares fueron algo diferentes. Evidentemente, el tipo celular debe ser tenido en cuenta a la hora de diseñar experimentos in vitro para entender los efectos de la radiación crónica de dosis baja en las poblaciones celulares.The present research was undertaken in order to study the effect of repeated low doses of radiation on two different cell lines from the same species. An in vitro model test was developed to avoid the influence of the confounding factors affecting epidemiological studies and to simulate a chronic exposure (50 mSv of x-rays during ten consecutive days). Comet assay and early apoptosis were analyzed immediately after exposure and after chronic irradiation. Sequential irradiation induced an increase of cells showing DNA damage. Index Damage was higher than that of the controls in both cell lines immediately after exposure and after chronic irradiation; these differences between exposed and control cells were statistically significant only for the transformed cell line after chronic irradiation (p<0.001). Significantly higher levels of apoptosis were scored after chronic exposure in both cells lines (p<0.001). The induction of DNA damage and apoptosis in hamster cells by chronic exposure to low dose ionizing radiation was demonstrated. Cell types reacted differently to chronic exposure; though further investigation is needed to understand the mechanisms of radiation effects on chronic low-dose-exposed cell populations, cellular type should be taken into account in the design of in vitro experiments to understand low-dose-irradiation effects.Instituto de Genética Veterinari

Possible radioprotective effect of folic acid supplementation on low dose ionizing radiation-induced genomic instability <i>in vitro</i>

Ionizing radiation (IR) induces DNA damage through production of single and double-strand breaks and reactive oxygen species (ROS). Folic acid (FA) prevents radiation-induced DNA damage by modification of DNA synthesis and/or repair and as a radical scavenger. We hypothesized that in vitro supplementation with FA will decrease the sensitivity of cells to genetic damage induced by low dose of ionizing radiation. Annexin V, comet and micronucleus assays were performed in cultured CHO cells. After 7 days of pre-treatment with 0, 100, 200 or 300 nM FA, cultures were exposed to radiation (100 mSv). Two un-irradiated controls were executed (0 and 100 nM FA). Data were statistically analyzed with X2-test and linear regression analysis (P in vitro; folate status should be taken into account when studying the effect of low dose radiation in environmental or occupational exposure.Facultad de Ciencias VeterinariasFacultad de Ciencias Naturales y MuseoInstituto de Genética Veterinari

Possible radioprotective effect of folic acid supplementation on low dose ionizing radiation-induced genomic instability <i>in vitro</i>

Ionizing radiation (IR) induces DNA damage through production of single and double-strand breaks and reactive oxygen species (ROS). Folic acid (FA) prevents radiation-induced DNA damage by modification of DNA synthesis and/or repair and as a radical scavenger. We hypothesized that in vitro supplementation with FA will decrease the sensitivity of cells to genetic damage induced by low dose of ionizing radiation. Annexin V, comet and micronucleus assays were performed in cultured CHO cells. After 7 days of pre-treatment with 0, 100, 200 or 300 nM FA, cultures were exposed to radiation (100 mSv). Two un-irradiated controls were executed (0 and 100 nM FA). Data were statistically analyzed with X2-test and linear regression analysis (P in vitro; folate status should be taken into account when studying the effect of low dose radiation in environmental or occupational exposure.Facultad de Ciencias VeterinariasFacultad de Ciencias Naturales y MuseoInstituto de Genética Veterinari

Possible radioprotective effect of folic acid supplementation on low dose ionizing radiation-induced genomic instability <i>in vitro</i>

Ionizing radiation (IR) induces DNA damage through production of single and double-strand breaks and reactive oxygen species (ROS). Folic acid (FA) prevents radiation-induced DNA damage by modification of DNA synthesis and/or repair and as a radical scavenger. We hypothesized that in vitro supplementation with FA will decrease the sensitivity of cells to genetic damage induced by low dose of ionizing radiation. Annexin V, comet and micronucleus assays were performed in cultured CHO cells. After 7 days of pre-treatment with 0, 100, 200 or 300 nM FA, cultures were exposed to radiation (100 mSv). Two un-irradiated controls were executed (0 and 100 nM FA). Data were statistically analyzed with X2-test and linear regression analysis (P in vitro; folate status should be taken into account when studying the effect of low dose radiation in environmental or occupational exposure.Facultad de Ciencias VeterinariasFacultad de Ciencias Naturales y MuseoInstituto de Genética Veterinari

In vitro approach to the study of chronic exposure to low doses of x-rays

El presente trabajo fue realizado con el fin de estudiar el efecto de dosis bajas y repetidas de radiación sobre dos líneas celulares de la misma especie. Se desarrolló un modelo in vitro para evitar la influencia de los factores de confusión que afectan a los estudios epidemiológicos y para simular una exposición crónica. Las técnicas utilizadas fueron el ensayo cometa y el análisis de apoptosis temprana; estas se llevaron a cabo inmediatamente después de la exposición y luego de la irradiación crónica. La irradiación secuencial indujo un aumento de células con daño en el ADN. El índice de daño fue mayor que el de los controles en ambas líneas celulares, tanto inmediatamente después de la exposición como luego de la irradiación crónica. Este aumento fue estadísticamente significativo solamente para la línea celular transformada luego de la irradiación crónica (p<0,001). El análisis de apoptosis arrojó niveles significativamente mayores al control para ambas líneas celulares luego de la exposición crónica (p<0.001). Se demostró que la exposición crónica a radiación ionizante de dosis bajas indujo daño en el ADN y apoptosis en células de hámster chino cultivadas in vitro. Las respuestas de ambos tipos celulares fueron algo diferentes. Evidentemente, el tipo celular debe ser tenido en cuenta a la hora de diseñar experimentos in vitro para entender los efectos de la radiación crónica de dosis baja en las poblaciones celulares.The present research was undertaken in order to study the effect of repeated low doses of radiation on two different cell lines from the same species. An in vitro model test was developed to avoid the influence of the confounding factors affecting epidemiological studies and to simulate a chronic exposure (50 mSv of x-rays during ten consecutive days). Comet assay and early apoptosis were analyzed immediately after exposure and after chronic irradiation. Sequential irradiation induced an increase of cells showing DNA damage. Index Damage was higher than that of the controls in both cell lines immediately after exposure and after chronic irradiation; these differences between exposed and control cells were statistically significant only for the transformed cell line after chronic irradiation (p<0.001). Significantly higher levels of apoptosis were scored after chronic exposure in both cells lines (p<0.001). The induction of DNA damage and apoptosis in hamster cells by chronic exposure to low dose ionizing radiation was demonstrated. Cell types reacted differently to chronic exposure; though further investigation is needed to understand the mechanisms of radiation effects on chronic low-dose-exposed cell populations, cellular type should be taken into account in the design of in vitro experiments to understand low-dose-irradiation effects.Instituto de Genética Veterinari

Genomic instability related to zinc deficiency and excess in an in vitro model : Is the upper estimate of the physiological requirements recommended for children safe?

Micronutrients are important for the prevention of degenerative diseases due to their role in maintaining genomic stability. Therefore, there is international concern about the need to redefine the optimal mineral and vitamin requirements to prevent DNA damage. We analyzed the cytostatic, cytotoxic, and genotoxic effect of in vitro zinc supplementation to determine the effects of zinc deficiency and excess and whether the upper estimate of the physiological requirement recommended for children is safe. To achieve zinc deficiency, DMEM/Ham’s F12 medium (HF12) was chelated (HF12Q). Lymphocytes were isolated from healthy female donors (age range, 5–10 yr) and cultured for 7 d as follows: negative control (HF12, 60 μg/dl ZnSO4); deficient (HF12Q, 12 μg/dl ZnSO4); lower level (HF12Q + 80 μg/dl ZnSO4); average level (HF12Q + 180 μg/dl ZnSO4); upper limit (HF12Q + 280 μg/dl ZnSO4); and excess (HF12Q + 380 μg/dl ZnSO4). The comet (quantitative analysis) and cytokinesis-block micronucleus cytome assays were used. Differences were evaluated with Kruskal-Wallis and ANOVA (p 4) of the physiological requirement recommended for children proved to be the most beneficial in avoiding genomic instability, whereas the deficient, upper limit, and excess (12, 280, and 380 μg/dl) cultures increased DNA and chromosomal damage and apoptotic and necrotic frequencies.Instituto de Genética Veterinari

Suplementación de cultivos de sangre periférica con Sulfato de Zinc: inestabilidad genómica asociada a su deficiencia y exceso

Zinc (Zn) plays a vital role in children growth and is involved in DNA synthesis and maintenance processes. The current nutrient intake recommendations do not consider the levels required for maintaining genomic stability. The objective of this study is to analyze the cytotoxic and genotoxic effect of in vitro Zn supplementation to evaluate deficiency and excess, and the concentrations within the normal physiological range established for children (80-280 µg/dl). To achieve Zn deficiency, the HAMF12 medium (HF12) was chelated (HF12Q). Lymphocytes were isolated from healthy donors and cultured for 7 days: 1-control (HF12, 60 µg/dl SO4 Zn); 2-deficient (HF12Q, 0 µg/dl SO4 Zn); 3-80 (HF12Q + 80 µg/dl SO4 Zn); 4-180 (HF12Q + 180 µg/dl SO4 Zn); 5-280 (HF12Q + 280 µg/dl SO4 Zn); 6-380 (HF12Q + 380 µg/dl SO4 Zn). Comet and micronucleus assays were performed, and cell viability was determined. Differences were evaluated with χ2 and ANOVA (p<0.05). The DNA damage index (comet assay) was significantly higher in the deficient culture respect to the others. Only the 380 µg/dl dose showed significantly increased frequency in DNA damage in relation to the other supplemented cultures. Micronuclei frequency was significantly higher in the deficient, 280 and 380 µg/dl cultures in comparison with the control, 80 and 180 µg/dl. The higher frequency of chromosomal damage was observed at 380 µg/dl SO4 Zn. In vitro Zn supplementation reduced genomic instability. Supplementation with Zn at 80 µg/dl and 180 µg/dl proved to be the most beneficial in reducing genomic instability, whereas doses of 280 and 380 µg/dl would cause an increase in DNA damage.El Zinc (Zn) juega un papel vital en el crecimiento de los niños y participa en la síntesis y mantenimiento del ADN. Las actuales recomendaciones de ingesta de nutrientes no tienen en cuenta los niveles requeridos para el mantenimiento de la estabilidad genómica. El objetivo del trabajo es analizar el efecto citotóxico y genotóxico de la suplementación in vitro con Zn para evaluar la deficiencia y el exceso, así como las concentraciones dentro del rango fisiológico normal establecido para niños (80-280 µg/dl). Para lograr la deficiencia de Zn, el medio HAMF12 (HF12) fue quelado (HF12Q). Los linfocitos fueron aislados de donantes sanos y cultivados durante 7 días: 1-control (HF12, 60 µg/dl SO4 Zn); 2-deficiente (HF12Q, 0 µg/dl SO4 Zn); 3-80 (HF12Q + 80 µg/dl SO4 Zn); 4-180 (HF12Q + 180 µg/dl SO4 Zn); 5-280 (HF12Q + 280 µg/dl SO4 Zn); 6-380 (HF12Q + 380 µg/dl SO4 Zn). Se utilizaron los ensayos de micronúcleo y cometa y se determinó la viabilidad celular. Las diferencias fueron evaluadas con 2 y ANOVA (p<0,05). El índice de daño, resultó significativamente más alto en el cultivo deficiente respecto de los demás. Sólo la dosis 380 µg/ dl presentó frecuencias significativamente aumentadas en relación a los otros cultivos suplementados. La frecuencia de micronúcleos (MNi) fue significativamente mayor en los cultivos deficientes, 280 y 380 µg/dl, respecto del control, 80 y 180 µg/dl. La mayor fecuencia se observó en 380 µg/dl. La suplementación de los cultivos in vitro con zinc ayudaría a reducir la inestabilidad genómica. Las dosis más beneficiosas serían las de 80 y 180 µg/dl, en tanto que las de 280 y 380 µg/dl provocarían un aumento de daño en el ADN.Instituto de Genética VeterinariaFacultad de Ciencias Naturales y Muse

New insights into the reactivity of 2-halo-glycals: Ssynthesis of novel iodinated Oand S-glycosides

This; is the first report on the Ferrier rearrangement of 2-halo-glycals with; S-nucleophiles. We present herein the selective synthesis of new; 2-iodo-2,3-unsaturated O- and S-glycosides. We obtained in good yields and high; anomeric selectivity α-glycosydes. As a particular behaviour, we also; describe heteroaromatic thio sugar derivatives were the C3 addition was; performed in an alternative mechanism. A complete structure and conformation analysis; by NMR was also presented.Centro de Estudios de Compuestos OrgánicosCentro de Investigación y Desarrollo en Ciencias Aplicada