Desarrollo y optimización de técnicas que faciliten el diagnóstico genético. Aplicación a trastornos del metabolismo lipídico

El diagnóstico genético proporciona una información fundamental para la práctica clínica. No solamente puede proporcionar diagnósticos precisos o contribuir al diagnóstico diferencial sino que además puede orientar el tratamiento y permitir el desarrollo eficaz de una medicina preventiva. Esta aportación resulta especialmente importante en distintos trastornos del metabolismo lipídico, especialmente en los que resultan en una acumulación lipídica en el organismo. La hipercolesterolemia autosómica dominante (HAD) es uno de los trastornos de origen genético más frecuentes en población general. Provoca niveles plasmáticos muy elevados de lipoproteínas de baja densidad (LDL), lo que está relacionado con el desarrollo de aterosclerosis. La aterosclerosis es la principal causa de enfermedad coronaria, que a su vez es la principal causa de muerte en los países industrializados. Las lipidosis son un grupo de enfermedades causadas por la acumulación intracelular de distintas sustancias lipídicas. Son mucho menos frecuentes en población general, pero tienen una alta frecuencia en determinados grupos étnicos. El diagnóstico genético en ambos casos resulta de gran ayuda para la práctica clínica. Para facilitar el diagnóstico, se han desarrollado y optimizado métodos que permiten analizar los genes asociados con HAD: LDLR, APOB, PCSK9 y APOE; y los genes asociados con enfermedad de Gaucher (GBA) y enfermedad de Niemann-Pick (SMPD1, NPC1, NPC2). Los métodos de análisis se han validado con muestras clínicas, descubriendo nuevas variantes no descritas con anterioridad que permiten avanzar en el conocimiento de las bases moleculares de trastornos del metabolismo lipídico. <br /

Estudio Epidemiológico y funcional de variantes en el gen GLA, en pacientes con miocardiopatía hipertrófica de ventrículo izquierdo de origen desconocido

La enfermedad de Fabry (EF) es una patología lisosomal ligada al cromosoma X, debida al acúmulo de lípidos complejos (globotriaosilceramida principalmente) por un déficit de la enzima α-galactosidasa A (α-Gal A). La incidencia varía en los estudios de hipertrofia de ventrículo izquierdo (HVI). El objetivo es analizar la incidencia de la EF en pacientes con HVI de origen desconocido y realizar el estudio molecular y epidemiológico de las variantes genéticas identificadas. Se llevó a cabo un estudio multicéntrico seguido de una valoración transversal de las historias clínicas. Se determinó la α-Gal A en muestra de gota de sangre seca. Todas las mujeres, y los varones cuya α-Gal A normalizada≤70%, se les analizó el gen GLA mediante electroforesis capilar. Los pacientes en los que se identificaron variantes genéticas fueron más ampliamente estudiados. Se estudiaron 367 sujetos. El patrón de HVI más común fue el concéntrico (42%). Se secuenciaron todas las mujeres y el 26,9% de los varones, identificándose variantes en ambos géneros (11,4% mujeres; 4,9% varones): NP_000160.1:p.Ser126Gly relacionada con actividad residual, el alelo de pseudo-deficiencia NP_000160.1:p.Asp313Tyr y 3 variantes de significado incierto (VSI). 49 pacientes mostraron variantes en el promotor y/o intrones. Tras el análisis in silico de las 3 VSI, la variante NM_000169.2:c.192C>T se consideró como potencialmente patogénica, aun así, se realizó caracterización funcional de las 3 VSI mediante determinación de actividad enzimática en plasma y extracto leucocitario, estudio de grandes reordenamientos génicos, estudio de EMSA, estudio de transcritos alternativos mediante electroforesis y cuantificación de marcadores biológicos subrogados en plasma y orina. Los resultados obtenidos de estos estudios no permitieron confirmar la patogenicidad de ninguna de las 3 VSI, incluso de NM_000169.2:c.192C>T a pesar de los resultados obtenidos in silico. Se realizó un estudio de segregación haplotípica para el resto de variantes identificadas en el estudio genético, estableciendo como mayoritarios 3 haplotipos compuestos por variantes en regiones no codificantes (haplotipo complejo intrónico, HCI). Previa a la caracterización funcional de los HCI se realizó un estudio de asociación estadística de todos los marcadores genéticos que formaban parte de los HCI vs la actividad α-Gal A en gota de sangre seca; una vez se realizó este estudio, se procedió a caracterizar funcionalmente los HCI mediante determinación de actividad enzimática en plasma y extracto leucocitario, estudio de grandes reordenamientos génicos, secuenciación de regiones no codificantes del gen GLA, estudio de EMSA, estudio de transcritos alternativos mediante electroforesis, estudio de la expresión génica, cuantificación de marcadores biológicos subrogados en plasma y orina y cuantificación del acúmulo intracelular de sustratos mediante técnicas de inmunohistoquímica. Los resultados obtenidos de estos estudios indicaron que tan solo el HCI tipo I mostró una reducción significativa de la actividad α-Gal A en gota de sangre seca. Se identificaron nuevos marcadores genéticos en regiones intrónicas profundas tanto en HCI tipo I como tipo III. No se observó niveles elevados de biomarcadores en plasma y orina. No se identificaron reordenamientos patogénicos en el gen GLA. La actividad enzimática de α-Gal A en extracto leucocitario se encontraba significativamente reducida en los pacientes con HCI tipo I, observándose también en ellos una reducción de la expresión del gen GLA y un acúmulo intracelular de manera difusa de globotriaosilceramida a partir de los estudios realizados en cultivo primario de fibroblastos. La incidencia de la EF en nuestro estudio fue nula, sin embargo, se identificaron 3 VSI y varios HCI. El HCI tipo I mostró una reducción significativa de la actividad enzimática, regulación a la baja de la expresión del gen GLA y acúmulo intracelular de sustrato.<br /

Síntesis y caracterización de la variante de la Apolipoproteína A-I (APO A-I Zaragoza) y análisis de posibilidades de uso farmacológico

La apolipoproteína A-I Zaragoza (apo A-I Z, mutación L144R) es una variante de la apolipoproteína A-I cuyos portadores tienen muy baja concentración de colesterol-HDL (c-HDL) pero, aunque presenten factores de riesgo aterogénicos adicionales, paradójicamente no muestran signos de aterosclerosis a nivel subclínico. Estudios metabólicos in vivo realizados previamente en portadores heterocigotos de esta variante de apo A-I revelaron que tiene una tasa de catabolismo que duplica la de la proteína nativa sugiriendo la posibilidad de que tuviera un efecto favorable sobre el proceso global de transporte reverso de colesterol. El objetivo de este trabajo fue establecer un sistema de expresión y purificación de apo A-I nativa y apo A-I Z recombinantes de alto rendimiento y elevada pureza con el fin de comparar in vitro sus propiedades en distintos aspectos relativos al transporte reverso de colesterol, así como otras características antiaterogénicas de la apo A-I. Se han optimizado la expresión y el método de purificación de la apo A-I nativa y apo A-I Z además de producir partículas reconstituidas similares a la HDL (rHDL) para poder realizar una caracterización estructural y funcional. La caracterización estructural incluyó análisis mediante espectrometría de masas, estudios de tamaño y estructura mediante FPLC y electroforesis en geles no desnaturalizantes, microscopía electrónica de transmisión para analizar las partículas reconstituidas y estudio de la estabilidad proteica mediante desnaturalización térmica. Los resultados de las distintas técnicas sugieren la existencia de diferencias a nivel estructural. La apo A-I Z parece adoptar una conformación más abierta tanto en forma de proteína libre como en partículas rHDL. Asimismo el patrón de desnaturalización térmica indica que la apo A-I Z sería menos estable que la forma nativa. La caracterización funcional consistía en el estudio del proceso de eflujo de colesterol desde macrófagos, utilizando un marcaje radiactivo, y en el estudio de la captación de colesterol por parte de una línea celular hepática a través de microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. El análisis de la variante apo A-I Zaragoza mostró una mayor eficacia en la cesión de colesterol a células hepáticas y un ligero aumento en el eflujo de colesterol desde macrófagos, lo cual contribuiría a explicar parcialmente sus propiedades ateroprotectoras

Uso de un compueso de fórmula (I) para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de la enfermedad de Gaucher, composición farmacéutica, un compuesto de fórmula (Ib) y procedimiento de obtención

Uso de un compuesto de fórmula (I) para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de la enfermedad de Gaucher en un sujeto humano, una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), compuestos de fórmula (Ib) y su procedimiento de obtención.Peer reviewedCentro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras, Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud, Universidad de Zaragoza, Universidad de Málaga, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universidad de SevillaA1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnic

Uso de un compuesto de fórmula (I) para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de la enfermedad de Gaucher, composición farmacéutica, un compuesto de fórmula (IB) y procedimiento de obtención

[EN] Use of a compound of formula (I) to manufacture a medicament for treating Gaucher's disease in a human subject, a pharmaceutical composition comprising a compound of formula (I), compounds of formula (Ib) and method for obtaining said compounds.[ES] Uso de un compuesto de fórmula (I) para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de la enfermedad de Gaucher en un sujeto humano, una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), compuestos de fórmula (Ib), y su obtención.Peer reviewedCentro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (España), Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud (España), Universidad de Zaragoza (España), Universidad de Málaga (España), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España)A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnic

Bicyclic Derivatives of L-Idonojirimycin as Pharmacological Chaperones for Neuronopathic Forms of Gaucher Disease

New human β-glucocerebrosidase (GCase) ligands with rigid 1,6-anhydro-β-L-idonojirimycin cores have been designed with the aid of molecular modeling. Efficient pharmacological chaperones for the L444P (trafficking-incompetent) mutant GCase enzyme associated with type 2 and 3 Gaucher disease (GD) were identified.Peer Reviewe