Evaluation of the role of HSP70 deficiency in the inflammatory response in vivo and in vitro

Heat Shock proteins (HSPs), especially the 70-kDa heat shock protein (HSP70),are a family of highly conserved proteins, also known as “stress response proteins”,involved in the basic mechanisms of cellular protection and play key role in theregulation of the immune response. HSP expression is highly induced by different typesof agents and catabolic stimuli, such as oxidative, thermal and metabolic stresses aswell as, infection, inflammation and intense exercise.Glutamine (GLN) has been shownto play a protective role against inflammatory injury and illness in experimental andclinical settings. Several studies have suggested a bidirectional relationship betweenGLN-mediated protection and enhanced HSP70, but the exact mechanism is not fullyunderstood yet.The aim of the present study was to explore the mechanism through whichHSP70 is involved in systemic inflammation and the role of GLN as part of thismechanism. For this purpose, we utilized mice with specific deletion of the Hsp70.1and Hsp70.3 genes for the in vivo studies and primary macrophages were collected fromHsp70+/+ and Hsp70-/-for the in vitro studies. Macrophages play an essential role ininflammation and host defense, regulating the immune response and maintaining tissuehomeostasis. Thus, we investigate the role of HSP70 in LPS-induced systemicinflammation both in vivo and in vitro.Our study provides clear evidence that HSP70 deficiency is associated withlower cytokine levels in plasma and lung tissue. On the contrary, HSP70 gene deletionleads to an increased inflammatory response by peritoneal murine macrophages fromHsp70-/- mice, which produced significantly increased levels of TNF-α, IL-6 and IL-8compared with Hsp70 +/+ mice-derived macrophages, after LPS stimulation.In conclusion, this phD thesis showed that the absence of HSP70 is associatedin vivo with a reduced inflammatory response, while in vitro, the lack of HSP70 isassociated with a pro-inflammatory phenotype. Our data suggest that the reducedinflammatory response observed in the absence of HSP70 in vivo is likely dependenton the anti-inflammatory action of glucocorticosteroids. Furthermore, HSP70 may notplay a significant role in attenuating the inflammatory response after GLNadministration in LPS-induced inflammation, suggesting alternatives pathways thatbypass the innate immune response. Alternatively, in the absence of HSP70, HSP90expression may be necessary for the development of an inflammatory response. Thus,measuring HSP90 levels in macrophages may be a potential marker for theinflammatory response.Οι πρωτεΐνες θερμικής καταπληξίας (Heat Shock Proteins - HSPs),συμπεριλαμβανομένης της πρωτεΐνης των 70-kDa (HSP70), είναι μια οικογένειαπρωτεϊνών υψηλής συντήρησης, γνωστές και ως «πρωτεΐνες απόκρισης στο στρες»,που εμπλέκονται στους βασικούς μηχανισμούς κυτταρικής προστασίας καιδιαδραματίζουν βασικό ρόλο στην ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης. Η έκφρασητων HSPs επάγεται σημαντικά από πληθώρα παραγόντων και καταβολικά ερεθίσματα,όπως οξειδωτικό, θερμικό και μεταβολικό στρες, καθώς και, λοίμωξη, φλεγμονή καιέντονη άσκηση.Η γλουταμίνη (GLN) έχει δειχθεί ότι διαδραματίζει προστατευτικό ρόλο έναντιφλεγμονωδών τραυματισμών και ασθενειών σε πειραματικά και κλινικά μοντέλα.Αρκετές μελέτες έχουν προτείνει μια αμφίδρομη σχέση μεταξύ της μεσολαβούμενηςαπό GLN προστασίας και της ενισχυμένης έκφρασης της HSP70, αλλά ο ακριβήςμηχανισμός δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητός.Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει τον μηχανισμό μέσω τουοποίου η HSP εμπλέκεται στη συστηματική φλεγμονή και την πιθανή αλληλεπίδρασηκαι συμμετοχή της στο μηχανισμό δράσης της GLN. Για το σκοπό αυτόχρησιμοποιήθηκαν μύες με ειδική διαγραφή των γονιδίων Hsp70.1 και Hsp70.3 για τιςin vivo μελέτες και πρωτογενείς καλλιέργειες μακροφάγων που συλλέχθηκαν απόHsp70 + / + και Hsp70 - / - μύες για τις in vitro μελέτες. Τα μακροφάγα παίζουνουσιαστικό ρόλο στη φλεγμονή και την άμυνα του ξενιστή, ρυθμίζοντας τηνανοσοαπόκριση και διατηρώντας την ομοιόσταση των ιστών. Έτσι, διερευνήσαμε τορόλο της HSP70 στη συστηματική φλεγμονή που προκαλείται από LPS τόσο in vivoόσο και in vitro.Η μελέτη μας παρέχει σαφείς ενδείξεις ότι η ανεπάρκεια HSP70 σχετίζεται μεχαμηλότερα επίπεδα κυτοκινών στο πλάσμα και στους πνεύμονες. Αντίθετα, ηδιαγραφή του γονιδίου της HSP70 οδηγεί σε αυξημένη φλεγμονώδη απόκριση απόπεριτοναϊκά μακροφάγα Hsp70-/- μυών, τα οποία παρήγαν σημαντικά αυξημέναεπίπεδα TNFα, IL-6 και IL-8 σε σύγκριση με τα μακροφάγα που προέρχονται απόHsp70+/+, μύες μετά από διέγερση με LPS. Χορήγηση γλουταμίνης δεν είχεστατιστικά σημαντική επίδραση στην έκφραση των κυτοκινών που μελετήθηκαν καιστους δύο γονότυπους. Είναι ενδιαφέρον ότι οι μύες Hsp70-/- εκκρίνουν σημαντικάαυξημένα επίπεδα κορτικοστερόνης σε σύγκριση με τους αντίστοιχους αγρίου τύπου,στις τέσσερις ώρες μετά τη συστηματική φλεγμονή επαγόμενη από LPS.Συμπερασματικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή έδειξε πως η απαλοιφή τηςHSP70 σχετίζεται in vivo με μειωμένη φλεγμονώδη απόκριση, ενώ in vitro, η έλλειψητης HSP70 σχετίζεται με προφλεγμονώδη φαινότυπο. Τα δεδομένα μας, υποδηλώνουνότι η μειωμένη φλεγμονώδης απόκριση, που παρατηρείται απουσία της HSP70 in vivo,πιθανότατα να εξαρτάται από την αντι-φλεγμονώδη δράση τωνγλυκοκορτικοστεροειδών. Επιπλέον, η HSP70 μπορεί να μην παίζει σημαντικό ρόλοστην εξασθένιση της φλεγμονώδους απόκρισης μετά τη χορήγηση της γλουταμίνηςστην LPS-επαγόμενη φλεγμονή, υποδηλώνοντας εναλλακτικά μονοπάτια τα οποίαπαρακάμπτουν την εγγενή ανοσολογική απόκριση. Εναλλακτικά, απουσία της HSP70,η έκφραση της HSP90 πιθανά να είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη φλεγμονώδουςαπόκρισης

Καθαρισμός και Διερεύνηση Κρυσταλλογένεσης του Μεταλλάγματος Cys 23 Ala της Pseudomonas syringae pv phaseolicola

The type III secretion system is a transporter mechanism of gram-negative bacterial effectors. HrcQb of the Psudomonas syringae is a conserved component of the type III secretion apparatus in gram-negative bacteria. The C-terminal region of this protein, the 79 residues, is the part where significant similarities with the homologous proteins are observed. These homologous proteins also participate in the export mechanism for the flagellum assembly. The crystal structure, as determined by Dr. V. Fadouloglou, of HrcQb-C is an elongated, gently curved homotetramer which can be characterized as an overwhelmingly beta-structure. We focused on the mutation C23A of HrcQb-C, and on the impact in crystallization of the absence of the disulfide bond. The molecule C23A HrcQb-C was overexpressed in E.coli cells and purified. Unfortunatelly, all the crystallization attempts were unsuccessfull as the molecule was very sensitive to proteolysis even in the presence of protein inhibitors at low temperatures.Το τύπου ΙΙΙ εκκριτικό σύστημα αποτελεί ένα μηχανισμό μεταφοράς πρωτεϊνών μολυσματικότητας στα gram-αρνητικά βακτήρια. Η πρωτείνη HrcQb του φυτοπαθογόνου Pseudomonas syrinagae αποτελεί συντηρημένο μέλος της τύπου ΙΙΙ εκκριτικής μηχανής των gram-αρνητικών βακτηρίων. Το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεϊνης αυτής (HrcQb-C), τα 79 κατάλοιπα, είναι το τμήμα όπου συγκεντρώνονται υψηλές ομοιότητες με τις άλλες ομόλογες πρωτεϊνες που συμμετέχουν και στο μηχανισμό βιογένεσης του μαστιγίου. Η κρυσταλλική δομή της HrcQb-C όπως αυτή καθορίστηκε από την δρ. Β. Φαδούλογλου είναι ένα επιμήκες, ελαφρά κυρτωμένο ομοτετραμερές με κύριο στοιχείο δευτεροταγούς δομής την β-πτυχωτή επιφάνεια. Η προσοχή μας εστιάστηκε στο μετάλλαγμα C23A της HrcQb-C, κατά πόσο μπορεί να ευοδώσει κρυστάλλους παρά την έλλειψη του δισουλφιδικού δεσμού στο μόριό της. Το μετάλλαγμα υπερεκφράστηκε σε κύτταρα E.coli και καθαρίστηκε. Όμως όλες οι προσπάθειες κρυστάλλωσης απέβησαν άκαρπες καθώς το πρωτεϊνικό αυτό μόριο είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο σε πρωτεόλυση

Evaluation of HSP70 deficiency in the inflammatory response in vivo and in vitro: The impact of HSP90 expression, glucocorticoid release, and glutamine administration

The present study aimed to explore the pathway through which Heat Shock Protein 70 (HSP70) is involved in inflammation and sepsis and the possible interaction with glutamine, an essential nutrient during sepsis. We also evaluated the possible interaction of HSP70 with HSP90, another HSP involved in sepsis. Therefore, we utilized mice with specific deletion of the Hsp70.1 and Hsp70.3 genes (Hsp70-/-) and their wild type littermates (Hsp70+/+) for the in vivo studies and primary macrophages collected from Hsp70+/+ and Hsp70-/- mice for the in vitro studies. We found that HSP70 deficiency was associated with lower inflammatory cytokine levels in plasma and lung tissue and increased levels of glucocorticoid secretion during inflammation in vivo. On the contrary, Hsp70-/- murine peritoneal macrophages showed increased inflammatory response compared to Hsp70+/+ macrophages, following LPS stimulation. Glutamine administration repressed the in vivo secretion of plasma cytokines from Hsp70-/- mice while enhanced the in vitro secretion of cytokines from macrophages of the same genotype (Hsp70-/-), but it did not affect the secretion of cytokines from wild type mice either in vivo or in vitro, following LPS treatment. Our data also demonstrated that HSP70 deficiency was associated with increased glucocorticoid release, in vivo. In vitro, pre-treatment of macrophages from both genotypes with HSP90 inhibitor significantly attenuated IL-6 secretion only from Hsp70-/- cells, following LPS treatment. In summary, in vivo, the lack of HSP70 leads to an anti-inflammatory phenotype, while in vitro, the lack of HSP70 in macrophages gives rise to a proinflammatory phenotype, which may be mediated by the HSP90. Both in vivo and in vitro, glutamine treatment responses in Hsp70-/- mice suggest alternative pathways bypassing HSP70

Heat Shock Protein 72 Expressing Stress in Sepsis: Unbridgeable Gap between Animal and Human Studies—A Hypothetical “Comparative” Study

Heat shock protein 72 (Hsp72) exhibits a protective role during times of increased risk of pathogenic challenge and/or tissue damage. The aim of the study was to ascertain Hsp72 protective effect differences between animal and human studies in sepsis using a hypothetical “comparative study” model. Forty-one in vivo (56.1%), in vitro (17.1%), or combined (26.8%) animal and 14 in vivo (2) or in vitro (12) human Hsp72 studies (P<0.0001) were enrolled in the analysis. Of the 14 human studies, 50% showed a protective Hsp72 effect compared to 95.8% protection shown in septic animal studies (P<0.0001). Only human studies reported Hsp72-associated mortality (21.4%) or infection (7.1%) or reported results (14.3%) to be nonprotective (P<0.001). In animal models, any Hsp72 induction method tried increased intracellular Hsp72 (100%), compared to 57.1% of human studies (P<0.02), reduced proinflammatory cytokines (28/29), and enhanced survival (18/18). Animal studies show a clear Hsp72 protective effect in sepsis. Human studies are inconclusive, showing either protection or a possible relation to mortality and infections. This might be due to the fact that using evermore purified target cell populations in animal models, a lot of clinical information regarding the net response that occurs in sepsis is missing