Conidiogênese de variantes deteriorados da linhagem Abnc de Aspergillus nidulans

A linhagem Abnc de A. nidulans é portadora do gene bncA1 ("binucleated conidia"), que confere a característica de conídios bi e trinucleados, além de apresentar uma região duplicada do cromossomo I e translocada para o cromossomo II (I->;II), gerando instabilidade genética com formação de setores deteriorados. Este trabalho analisou citologicamente a conidiogênese dos variantes deteriorados isolados da linhagem Abnc de A. nidulans, observando a ocorrência de alterações das estruturas que compõe o conidióforo e as variações no número de núcleos dos esterígmas e conídios. As análises citogenéticas da conidiogênese foram realizadas com períodos pré-determinados, sendo efetuada a coloração de Giemsa para observação dos núcleos, e análise por Microscopia Eletrônica de Varredura, para observação das estruturas que compõe o conidióforo. Os variantes deteriorados analisados apresentaram alterações na estrutura das células-pé, métulas e fiálides, redução do número de conidióforos e conídios, e formação de conidióforos secundários. Estas alterações no conidióforo podem estar relacionadas com os genes para o desenvolvimento, bristle e com atividade das proteínas NIMA e NINXcdc2 (envolvidas com o ciclo regulatório da morfogênese) as quais induzem a expressão de brislte, estabelecendo o caminho para a regulação e controle da expressão dos genes durante o desenvolvimento do conidióforo.The Abnc strain of A. nidulans carries the bncA1 gene (binucleated conidia), which induces the formation of binucleate and trinucleate conidia, displaying a chromosome I duplicated area and shifted to the chromosome II (I->;II), and bringing forth genetic instability with degenerated sectors. This work has considered in a cytological level the conidiogenesis of the deteriorated variants isolated from the Abnc strain of A. nidulans, observing the event at the level of structural alterations, which composes the conidiophore, and the variations in the number of sterigmata and conidia nuclei. Cytogenetic analyses of conidiogenesis were accomplished in predetermined periods, under Giemsa stain, to observe the nuclei and analysis through the Scanning Electronic Microscopy, and also the structures that composes the conidiophore. The analyzed, deteriorated variants presented alterations in the cell-foot, metulae and phialides structure, conidiophore number and conidias reduction, and the formation of secondary conidiophores. These alterations can be related to genes for the development, bristle, and activities of NIMA e NINXcdc2 (involved in morphogenesis regulatory cycle) that induce the expression of brislte, establishing the link to the regulation and expression of the genes control throughout the conidiophore development

Variabilidade genética e compatibilidade vegetativa de isolados de Erythricium salmonicolor

A rubelose é uma doença causada pelo fungo Erythricium salmonicolor que atinge muitos hospedeiros, como citros, café, seringueira, eucalipto, Acacia sp., infectando principalmente os galhos. Rubelose é um sério problema para o Brasil, reduzindo a produção de citros em valores próximos de 10%. A diversidade do fungo E. salmonicolor em cultivares brasileiras ainda não foi avaliada. Este trabalho teve como objetivos: i) avaliar a variabilidade genética, por meio de RAPD, de 19 isolados de E. salmonicolor provenientes de diferentes regiões citrícolas de São Paulo e Minas Gerais, ii) avaliar a compatibilidade vegetativa e fusão de hifas do fungo E. salmonicolor. Após a análise por RAPD, foram observados 6 grupos distintos, os quais não apresentaram correlação com o local de origem e espécie hospedeira. No teste de compatibilidade vegetativa, houve encontro de hifas em todos os cruzamentos e 84% destes apresentaram fusão entre elas. Foi verificada compatibilidade entre linhagens, embora não tenha sido observada correlação com os haplótipos. Os resultados observados neste trabalho indicam a importância de futuros estudos sobre a fase sexual do fungo E. salmonicolor, uma vez que a anastomose de hifas precede a formação de heterocário, onde ocorrem os processos de recombinação sexual e parassexual responsáveis pela variabilidade genética em fungos filamentosos.The Pink Disease is caused by Erythricium salmonicolor, which attacks broad hosts, such as citrus, coffee, rubber, Eucalyptus spp. and Acacia spp., infecting mainly branches. This disease became a serious problem in Brazil, reducing the citrus production up to 10%. However the genetic diversity and compatibility of the fungus E. salmonicolor from Brazilian citrus plants is not yet evaluated. Therefore, the aims of this study were to evaluate: i) the genetic variability of E. salmonicolor in the São Paulo and Minas Gerais States by the RAPD technique, and ii) the vegetative compatibility between these isolates. After RAPD analysis, six distinct groups were observed without correlation between the isolation site or host species. In the vegetative compatibility test, the contact of fungal hyphae between all evaluated crosses was observed, of which 84% presented hyphal fusion. Although the compatibility between strains was observed, no correlation between RAPD haplotypes and hyphal anastomosis was verified. These results show the importance of future studies on the sexual cycle of E. salmonicolor, since hyphal fusion, which precedes the formation of heterokaryons (sexual and parasexual reproduction) that could be responsible for the genetic variability in this species

Guignardia citricarpa resistance to benzimidazoles

O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência de Guignardia citricarpa aos fungicidas carbendazim e piraclostrobina, por meio de avaliação do crescimento em meio de cultura, decomposição de tecido foliar e produção de corpos de frutificação. Para isso, o fungo G. citricarpa foi isolado de lesões de frutos de laranja (Citrus sinensis), produzidos em área com intensa aplicação de fungicida. Os isolados obtidos foram avaliados quanto à sensibilidade aos fungicidas piraclostrobina e carbendazim, nas dosagens de 0,5, 1 e 2 mg mL-1 de i.a., para se verificar o efeito da pressão de seleção causada pelo uso destes compostos em áreas citrícolas. Embora tenha sido observada redução efetiva no número de estruturas reprodutivas e na decomposição de folhas e frutos infectados com G. citricarpa, após a aplicação dos fungicidas, 7,5% dos isolados avaliados sobre meio de cultura apresentaram resistência a esse fungicida, o que indica que pode ocorrer seleção de isolados resistentes no campo. Para a piraclostrobina não foi observada resistência, o que indica que pode ser um composto alternativo para ser utilizado de forma alternada com carbendazim, para diminuir as chances de ocorrência de resistência do patógeno.The objective of this work was to evaluate the resistance of Guignardia citricarpa to pyraclostrobine and carbendazim fungicides, through: growth analysis in culture media amended with the fungicides; leaf decomposition; and production of reproductive structures on leaves naturally infected with these fungi. G. citricarpa was isolated from symptomatic fruits of sweet orange (Citrus sinensis) cultivated in area with intense fungicide application. The sensibility to fungicides of G. citricarpa isolates was evaluated with pyraclostrobine and carbendazim, in the doses 0.5, 1 e 2 mg mL-1 a.i., to verify the effect of selection pressure caused by continuous use of these compounds. Although, reduction on leaf decomposition and on the number of reproductive structures were observed after application of pyraclostrobine and carbendazim, 7.5% of the isolates, evaluated in culture media, exhibited resistance to carbendazim, suggesting that the use of this agrochemical must be combined to other active principles in a consortium to reduce the chances of resistance occurrence. No resistance to pyraclostrobine was observed among tested isolates, what indicates that this could be an alternative compound to be used in combination to carbendazim, to minimize the chance of resistance occurrence

Endophytic fungi from the Amazonian plant Paullinia cupana and from Olea europaea isolated using cassava as an alternative starch media source

Endophytic fungi live inside plants, apparently do not cause any harm to their hosts and may play important roles in defense and growth promotion. Fungal growth is a routine practice at microbiological laboratories, and the Potato Dextrose Agar (PDA) is the most frequently used medium because it is a rich source of starch. However, the production of potatoes in some regions of the world can be costly. Aiming the development of a new medium source to tropical countries, in the present study, we used leaves from the guarana (a tropical plant from the Amazon region) and the olive (which grows in subtropical and temperate regions) to isolate endophytic fungi using PDA and Manihot Dextrose Agar (MDA). Cassava (Manihot esculenta) was evaluated as a substitute starch source. For guarana, the endophytic incidence (EI) was 90% and 98% on PDA and MDA media, respectively, and 65% and 70% for olive, respectively. The fungal isolates were sequenced using the ITS- rDNA region. The fungal identification demonstrated that the isolates varied according to the host plant and media source. In the guarana plant, 13 fungal genera were found using MDA and six were found using PDA. In the olive plant, six genera were obtained using PDA and 4 were obtained using MDA. The multivariate analysis results demonstrated the highest fungal diversity from guarana when using MDA medium. Interestingly, some genera were isolated from one specific host or in one specific media, suggesting the importance of these two factors in fungal isolation specificity. Thus, this study indicated that cassava is a feasible starch source that could serve as a potential alternative medium to potato medium.This work was supported by a grant from the Foundation for Research Assistance, São Paulo State and Amazon State, Brazil (grant n. 2009/53376-2) and by the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq). We thank FAPESP for the M.C.Q. (grant no. 2010/50445-0), J.M. (grant no. 2011/18740-5) and S.T. (grant no. 2010/15192-4) and CNPq for E.F.S. and D.M.L. fellowships

The gene binA1 on conidia formation of Aspergillus nidulans

O presente trabalho foi realizado com a finalidade de estudar geneticamente o caráter produção de conídios uni, bi e trinucleados que ocorre em uma linhagem de Aspergillus nidulans designada MSEbin. Inicialmente foi feito o mapeamento do gene responsável por este caráter, a determinação da origem dos núcleos adicionais nos conídios, o efeito deste gene em heterocários, na meiose, na instabilidade genética e finalmente, o efeito de agentes como luz ultravioleta e temperatura na sua expressão. Pela análise genética foi verificado que a formação de conídios com mais de um núcleo é determinada por um único gene, denominado binA1, o qual foi localizado no grupo de ligação IV à 22,7cM de methG1. Através da análise dos tipos de conídios formados em heterocários e de observações citológicas em diferentes estágios do desenvolvimento do conidióforo, foi possível concluir que os núcleos nos conídios bi e trinucleados podem ter origens diferentes, permitindo a formação de conídios heterocarióticos em micélios com núcleos geneticamente diferentes. O gene binA1 em heterocários tem expressão não autônoma e não interfere com o processo meiótico normal do fungo. Em dissômicos, a presença do gene binA1 acarreta um aumento de cerca cinco vezes na instabilidade, enquanto que, em linhagens duplicadas e em diplóides, tal instabilidade é reduzida de 2,2 e 2,0 vezes, respectivamente. As possíveis causas dessa redução da instabilidade são discutidas, bem como, a sua possível utilização em linhagens industriais. A linhagem que contêm o gene binA1 apesar de possuir conídios com mais de um núcleo, não é mais resistente à luz ultravioleta do que a linhagem original com conídios uninucleados. Através de mutação induzida com luz ultravioleta, o caráter estudado pode ser modificado obtendo-se linhagens com maior ou menor porcentagem de conídios com mais de um núcleo. Por outro lado, o caráter é influenciado pela temperatura, que sendo alta, ocasiona uma diminuição no número de conídios bi e trinucleados, o que sugere a presença de um produto termo-sensível envolvido no processo de migração dos núcleos da vesícula para os esterígmas primários.The mutant strain MSEbin de Aspergillus nidulans has conidia with one, two and three nuclei in constant proportions. This character was considered in the present study which comprise genetic mapping, origin determination of the additional nuclei in conidia and genetic influence on heterokaryons, meiosis and instability. It was also determined the effect of temperature and ultraviolet light. Genetic analysis have shown a single gene controlling the character, binA1, which is located in linkage group IV at 22,7 cM of methG1. Analysis of conidia type formation in heterokaryons and the cytological analysis of conidiophore in different stages of development permit to conclude that additional nuclei can have independent origin in conidia. Non-autonomous expression in heterokaryons was observed and meiosis in strains were not affected in the presence of binA1. In disomics the genes enhances instability about five times and on the contrary in duplicated and diploid strains instability is reduced about two times. These effects are discussed as well as the possible reduction of instability in industrial strains. Although with more than one nuclei strains with binA1 are not more resistant to ultraviolet light than the original strain. Mutation induced by UV light permitted to select strains with higher and lower percentages of conidia with more than a single nuclei. The character however is temperature influenced and the results permit to suggest the presence of a temperature-sensitive component involved in the process of nuclear migration to primary sterigmata