Diagnóstico anatomopatológico, imuno-histoquímico e biomolecular de um caso de miocardite por Clostridium chauvoei em um bovino

The aim of this study was to report a case of clostridial myocarditis in a bovine in Brazil with emphasis on the pathological findings, isolation and molecular identification associated with the in situ localization of C. chauvoei. The animal, a male Brangus bull with nine months of age, was found dead without prior clinical signs. Multifocal and coalescent areas of necrosis were observed in the myocardium. Rod cells in the cardiac muscle fibers were positive immunostaining for C. chauvoei, while this bacterium was also isolated and identified by polymerase chain reaction (PCR).O objetivo deste estudo foi relatar um caso de miocardite clostridial em um bovino no Brasil, com ênfase nos achados patológicos, isolamento e identificação molecular do agente e visualização in situ de C. chauvoei. O animal, um macho da raça Brangus com nove meses de idade, foi encontrado morto sem sinais clínicos prévios. Foram observadas áreas de necrose multifocal e coalescente no miocárdio, com a presença de bastonetes imunomarcados para C. chauvoei nas fibras musculares cardíacas. Uma estirpe de C. chauvoei foi isolada do tecido e sua identidade foi confirmada por reação em cadeia da polimeras (PCR)

Estudo patológico, padronização e uso da imuno-histoquímica em animais experimentalmente e naturalmente infectados com clostrídios histotóxicos

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-10T14:39:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 prhiscylla_pires_pdf.pdf: 2038959 bytes, checksum: 54fba6ac9e78ca97ed49f883d85d9380 (MD5) Previous issue date: 2Padronizou-se um teste de imuno-histoquímica (IHQ) para detectar C. septicum, C. chauvoei, C. novyi tipo A, C. perfringens tipo A e C. sordellii utilizando tecidos obtidos de cobaias experimentalmente infectadas com essas cepas. Além disso, estabeleceu-se e etiologia das mionecrose em um estudo retrospectivo de amostras provenientes de bovinos do Mato Grosso do Sul (MS) com diagnóstico clínico e/ou patológico de mionecrose. Os anticorpos primários foram obtidos após repetidas inoculações (dias 0, 28, 49, 70 e 91) de coelhos com cepas de referência de clostrídios histotóxicos. A purificação das imunoglobulinas foi realizada por meio de uma cromatografia de afinidade em coluna de proteína G sepharose. Para padronização da IHQ, as secções histológicas dos cobaios inoculados foram bloqueadas e incubadassucessivamente com: anticorpo primário, cuja diluição foi previamente padronizada, anticorpo secundário biotinilado e estreptavidina conjugada com peroxidase. A mesma técnica de IHQ foi utilizada no diagnóstico etiológico de mionecroses em material de ruminantes oriundos do MS (n=32). Tanto o protocolo de produção de soro hiperimune quanto o de purificação foram considerados satisfatórios para obtenção de anticorpo primário com elevados títulos na aglutinação (1:1.000 a 1:100.000) e na IHQ (1:30 a 1:4.000). Cerca de 22% dos casos foram positivos apenas para C. chauvoei, seguido de 19% positivos para C. perfringens tipo A. Os demais apresentaram associação de dois ou mais agentes. Com relação a freqüência de cadaum dos clostrídios estudados no diagnóstico retrospectivo, C. chauvoei foi o mais prevalente (73,3%), seguido por C. perfringens tipo A (53,3%), C. septicum (33,3%), C. sordellii (13,3) e C.novyi tipo A (10%). A técnica de IHQ padronizada mostrou-se eficiente na detecção de clostrídios histotóxicos. O padrão de distribuição dos bastonetes e as alterações histológicas foram semelhantes entre os grupos de cobaios experimentalmente e os naturalmente infectados. C. perfringens tipo A aparenta ser também, um agente causador de mionecrose em bovinos e ovinos, fato este que demonstra a importância desse agente ser também incluído nas vacinas contra o carbúnculo sintomático e a gangrena gasosa.An immunohistochemistry (IHC) was optimized to detect C. septicum, C. chauvoei, C. novyi type A, C. perfringens type A and C. sordellii using tissues obtained from guinea pigs experimentally infected with these strains. Furthermore, we established the etiologic diagnosis of myonecrosis in a retrospective study of samples from Mato Grosso do Sul (MS). Primary antibodies were obtained after repeated inoculations (days 0, 28, 49, 70 and 91) of rabbits with reference strains of Clostridium histotóxicos. Purification of immunoglobulins was performed using an affinity chromatography column of protein G sepharose. For standardization of IHC technical, histological sections from inoculated animals were blocked and incubated successively with: primary antibody, which the dilution was previously standardized dilution, biotinylated secondary antibody and streptavidin peroxidase conjugate. The IHC was used to established the etiological diagnosis of myonecrosis in ruminant material from MS (n = 32). The protocol for the production of hyperimmune serum and the purification were considered satisfactory for obtaining primary antibody with high titers in the agglutination (1:1000 to1:100,000) and IHC (1:30 to 1:4,000). Most cases from MS showed positive signal for C. chauvoei (22%), followed by a positive C. perfringens type A (19%). Other samples showed an association of two or more agents. Concerning the frequency of each of the clostridia studied, C. chauvoei was the most prevalent (73.3%) among the sections classified as positive, followed by C. perfringens type A (53.3%), C. septicum (33.3%), C. sordellii (13.3) and C. novyi type A (10%). The standard technique was efficient to detect all clostridia tested. The distribution pattern of the rods and histological changes were similar in both groups of animals experimentally and naturally infected and confirm data previously reported. C. perfringens tipo A apparently is also a cause of mionecrosis in bovine and sheep. This evidence showed the importance of this agent and could be included in vaccines against black leg and gas gangrene

Relação parasito-hospedeiro na infecção de macrófagos por Clostridium chauvoei

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-11T07:34:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 prhiscylla_sadan__pires.pdf: 1499875 bytes, checksum: 2f82248aa8d44abe5d5953ff01c81806 (MD5) Previous issue date: 29Clostridium chauvoei é o agente etiológico do carbúnculo sintomático, doença com alta taxa de letalidade e mortalidade que acomete bovinos jovens. Apesar da reconhecida importância dessa doença, a sua patogênese e os mecanismos de virulência do agente etiológico ainda não foram completamente elucidados. Dentre as lacunas de conhecimento, destaca-se o mecanismo envolvido no tráfego de C. chauvoei do intestino para a musculatura. Essa etapa, essencial para a deposição do esporo no sítio de infecção, permitiria que o agente permanecesse latente até que encontrasse condições favoráveis para germinar e multiplicar. Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade de sobrevivência de C. chauvoei após internalização de macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7 e macrófagos bovinos. Buscouse avaliar as diferenças quanto às taxas de sobrevivência da forma vegetativa com a esporulada, bem como o perfil de transcritos de citocinas induzidos pela infecção por uma dessas duas formas. Para isso, macrófagos da linhagem RAW 264.7 e macrófagos derivados de monócitos periféricos bovinos foram infectados com C. chauvoei na multiplicidade de infecção (MOI) 1:50 com uma das seguintes formas bacterianas: vegetativa ou esporo. A sobrevivência de C. chauvoei foi avaliada após 1 (T1), 24 (T24), 48 (T48) e 72 (T72) horas de infecção. Para se avaliar o perfil de transcritos de citocinas exibido por macrófagos bovinos infectados com C. chauvoei, os macrófagos foram infectados com C. chauvoei na MOI 1:50, sendo avaliados os tempos de T1, 6 (T6), 12 (T12) e T24 horas de infecção. Os transcritos de citocinas dosados foram: interleucina 10 (IL-10), IL-4, IL-12, IL-23 e fator de crescimento beta (TGF-beta). C. chauvoei, tanto na forma esporulada quanto vegetativa, é capaz de resistir ao processo microbicida dos macrófagos por até 72 horas de infecção. Contudo, o prolongamento da infecção com a forma vegetativa resultou em um decréscimo (p<0,01) do número de bactérias internalizadas viáveis a partir do T48 de infecção. Ao contrário, o número de esporos internalizados viáveis permaneceu constante ao longo dos tempos de infecção avaliados. Essa diferença de sobrevivência entre as formas infectantes (vegetativa e esporo) não foi demonstrada no modelo de infecção com macrófagos bovinos, no qual ambas as formas bacterianas permaneceram igualmente viáveis durante todo o período avaliado (T72). Com relação ao perfil de transcritos de citocinas, observou-se que os macrófagos bovinos infectados com C. chauvoei na forma predominantemente vegetativa detinham um perfil de transcritos de citocinas pró-inflamatórias como IL-12 e IL-23 (p<0,001).Esse perfil de transcritos de citocinas poderia contribuir para os efeitos microbicidas desses fagócitos. Ao contrário, quando os macrófagos bovinos foram infectados com C. chauvoei na esporulada, observou-se um perfil de citocinas anti-inflamátorias, como IL-10 e TGF-beta. Esse perfil de transcritos de citocinas poderia determinar a latência dessa forma bacteriana após internalização por macrófagos. Os resultados apresentados indicam que C. chauvoei na forma vegetativa e na forma esporulada são capazes de resistir aos efeitos microbicidas dos macrófagos, sendo a forma esporulada mais resistente à morte mediada por macrófagos por um período maior de infecção. Essa é a primeira evidência de que C. chauvoei é capaz de resistir aos efeitos microbicidas dos macrófagos e de que as formas infectantes (vegetativa e esporulada) exibem um perfil de transcritos de citocinas divergente.Clostridium chauvoei is the etiologic agent of blackleg, a high mortality disease that affects calves. Despite the recognized importance of this disease, its pathogenesis and microorganism virulence factors have not been fully elucidated. Among the knowledge absences, there is the mechanism involved in C. chauvoei bowel traffic to the muscles. This step is essential for spore deposition in infection site, the agent would remain dormant until they find favorable conditions to germinate and multiply. In light of this, the aim of this study was to evaluate the survivability of C. chauvoei after internalization of murine macrophage RAW 264.7 lineage and bovine macrophage. It was evaluated the differences in survival rates of vegetative and spore C. chauvoei and the cytokine profile of transcripts induced by infection with one of these two bacterial form. The RAW 264.7 macrophages and bovine macrophages derived from peripheral monocytes were infected with C. chauvoei at multiplicity of infection (MOI) 1:50 with one of bacterial forms: vegetative or spore. The survival of C. chauvoei was assessed after 1 (T1), 24 (T24), 48 (T48) and 72 (T72) hours of infection. To assess the cytokine transcripts profile from bovine macrophages infected with C. chauvoei at MOI 1:50, it was evaluated the times T1, 6 (T6), 12 (T12) and T24 hours of infection. Cytokine transcripts that were measured: interleukin 10 (IL-10), IL-4, IL-12, IL-23 and growth factor beta (TGF-beta). C. chauvoei, both the spore and vegetative form, resist to microbicide macrophages process for 72 hours for infection. However, the lengthening of infection with vegetative form resulted in a decrease (p <0.01) in the number of viable internalized bacteria at T48. In contrast, the number of viable spores internalized was constant over the time of infection evaluated. There were any differences in survival between the infective forms (vegetative and spore) in infection with bovine macrophages throughout the study period (T72). Regarding the cytokine transcripts profile, it was observed that bovine macrophages infected with vegetative C. chauvoei owned a pro-inflammatory cytokines profile, such as IL-12 IL-23 (p <0.001). This profile could contribute to the microbicidal effects of these phagocytes. Contrariwise, when bovine macrophages were infected with spores of C. chauvoei, it was observed an anti-inflammatory cytokines profile, such as IL-10 and TGF-beta. This profile could cause the latency of this bacterial medium after macrophages internalization. The present results indicate that C. chauvoei the vegetative and sporulated form are able to resist to microbicidal macrophages effects. Nevertheless, spore form showed to be more resistant to death mediated by macrophages over a longer period infection. This is the first evidence that C. chauvoei is able of resisting the microbicidal effects of macrophages and the infectious forms (vegetative and spore) exhibit a diverging cytokine transcripts profile

Blackleg: A Review of the Agent and Management of the Disease in Brazil

The genus Clostridium is an important group of pathogenic and nonpathogenic Gram-positive anaerobic bacteria with a sporulation capacity and wide distribution in different environments, including the gastrointestinal tracts of healthy and diseased animals and humans. Among the pathogenic species of the genus, Clostridium chauvoei stands out as a histotoxic agent. It causes significant myonecrosis such as blackleg, a disease with high lethality, especially in young cattle, and is responsible for significant livestock losses worldwide. The pathogenicity of the disease is complex and has not yet been fully elucidated. Current hypotheses cover processes from the initial absorption to the transport and deposition of the agent in the affected tissues. The virulence factors of C. chauvoei have been divided into somatic and flagellar antigens and soluble antigens/toxins, which are the main antigens used in vaccines against blackleg in Brazil and worldwide. This review provides important information on the first and current approaches to the agent C. chauvoei and its virulence factors as well as a compilation of data on Brazilian studies related to blackleg