Cytochrome P450 Inhibition by Antimicrobials and Their Mixtures in Rainbow Trout Liver Microsomes In Vitro

Antimicrobials are ubiquitous in the environment and can bioaccumulate in fish. In the present study, we determined the half-maximal inhibitory concentrations (IC50) of 7 environmentally abundant antimicrobials (ciprofloxacin, clarithromycin, clotrimazole, erythromycin, ketoconazole, miconazole, and sulfamethoxazole) on the cytochrome P450 (CYP) system in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) liver microsomes, using 7-ethoxyresorufin O-deethylation (EROD, CYP1A) and 7-benzyloxy-4-trifluoromethylcoumarin O-debenzylation (BFCOD, CYP3A) as model reactions. Apart from ciprofloxacin and sulfamethoxazole, all antimicrobials inhibited either EROD or BFCOD activities or both at concentrationsPeer reviewe

Vesiympäristön antibioottijäämien aiheuttama sytokromi P450 -entsyymien inhibitio kaloissa

Peer reviewe

Lääkeaineiden ympäristöriskin arvioinnin epävarmuuslähteitä

Finnish summary. English summary. Tieteellinen kommentti.nonPeerReviewe

Overcoming the Pitfalls of Cytochrome P450 Immobilization Through the Use of Fusogenic Liposomes

This work describes a new nanotechnology-based immobilization strategy for cytochrome P450s (CYPs), the major class of drug metabolizing enzymes. Immobilization of CYPs on solid supports provides a significant leap forward compared with soluble enzyme assays by enabling the implementation of through-flow microreactors for, for example, determination of time-dependent inhibition. Immobilization of the complex CYP membrane-protein system is however particularly challenging as the preservation of the authentic enzyme kinetic parameters requires the full complexity of the lipid environment. The developed strategy is based on the spontaneous fusion of biotinylated fusogenic liposomes with lipid bilayers to facilitate the gentle biotinylation of human liver microsomes that incorporate all main natural CYP isoforms. The same process is also feasible for the biotinylation of recombinant CYPs expressed in insect cells, same as any membrane-bound enzymes in principle. As a result, CYPs could be immobilized on streptavidin-functionalized surfaces, both those of commercial magnetic beads and customized microfluidic arrays, so that the enzyme kinetic parameters remain unchanged, unlike in previously reported immobilization approaches that often suffer from restricted substrate diffusion to the enzyme's active site and steric hindrances. The specificity and robustness of the functionalization method of customized microfluidic CYP assays are also carefully examined.Peer reviewe

Bioaccumulation of pharmaceutical residues in fish : In vitro evaluation of the impact of cytochrome P450 interactions

Pharmaceutical residues end up in the aquatic environment primarily via human and animal consumption and excretion, as is or as metabolites, into wastewater, further entering water basins either directly or after insufficient water purification. If drug residues are taken up by nontarget species, they may bioaccumulate in organs and tissues, resulting in organ toxicity or changes in reproduction or behavior, for example. Fish are especially susceptible to the adverse effects of pharmaceuticals since human drug targets are highly conserved in their genome. Cytochrome P450 (CYP) enzymes play the most significant role in xenobiotic metabolism in humans and presumably also in fish. In humans, CYP inhibition is a significant factor in drug–drug interactions, which may lead to drug accumulation or toxicity. CYP inhibition can also occur in fish, in which case a drug (residue) can prevent the elimination of another drug, especially since pharmaceuticals in the aquatic environment occur as mixtures. However, CYP inhibition in fish has not been extensively studied. In this study, fish metabolism was modeled in vitro using hepatic microsomes or S9 fractions of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). The first aim was to investigate whether CYP enzymes in fish are susceptible to inhibition by pharmaceutical residues. The results indicated that EROD (CYP1A) activity was highly prone to broad inhibition by a range of pharmaceuticals in vitro, while BFCOD (CYP3A) activity was less affected (I–III). However, the CYP1A substrate selectivity between fish and humans differed greatly, and, thus, direct read-across is likely implausible. The results revealed that inhibitory concentrations of individual compounds were generally orders of magnitude higher than the plasma concentrations measured in wild fish; however, they also indicated that as mixtures, pharmaceuticals may cause synergistic CYP inhibition in fish in vitro, even at trace-level concentrations (I). The second aim was to examine the impact of CYP inhibition on the hepatic elimination of pharmaceuticals in fish in vitro. In this context, the intrinsic hepatic clearance was measured according to OECD 319B test guidelines to extrapolate the bioconcentration factors and evaluate the bioaccumulation risk (III). The results of the CYP inhibition assays revealed that some pharmaceuticals can act as time-dependent inhibitors (I–III), which is often indicative of irreversible inactivation of the CYP pathway. Therefore, a novel microfluidic method was also developed to facilitate the straightforward differentiation of reversible and irreversible enzyme inhibitors (IV). This method was, however, validated using human liver microsomes since CYP inhibition mechanisms of pharmaceuticals are well known in humans though not in fish.Lääkejäämiä päätyy vesiympäristöön ihmis- ja eläinlääkkeiden käytöstä. Lääkeaineet voivat erittyä sellaisenaan tai metaboliitteina jätevesiin ja edelleen vesistöihin joko suoraan tai riittämättömän vedenpuhdistuksen seurauksena. Vesieliöihin kulkeutuessaan, lääkejäämiä voi kertyä elimiin tai kudoksiin ja ne voivat aiheuttaa esimerkiksi elintoksisuutta, sekä lisääntymisen, tai käyttäytymisen muutoksia. Kalat ovat erityisen alttiita lääkkeiden aiheuttamille haitoille, sillä humaanilääkkeiden vaikutuskohteita on runsaasti niiden genomeissa. Sytokromi P450 (CYP) -entsyymeillä on merkittävä rooli ihmisen ja oletettavasti myös kalojen vierasainemetaboliassa. Ihmisessä CYP-inhibitio on merkittävä tekijä lääke-lääke-yhteisvaikutuksissa, jotka voivat johtaa lääkkeiden kumuloitumiseen tai toksisuuteen. Myös kaloissa tapahtuu CYP-inhibitiota, jolloin lääke(jäämä) voi estää toisen lääkeaineen eliminaation, erityisesti, koska lääkeaineet esiintyvät vesistöissä seoksina. CYP-inhibitiota kaloissa ei kuitenkaan ole laajasti tutkittu. Tässä työssä kalan metaboliaa mallinnettiin hyödyntämällä kirjolohen (Oncorhynchus mykiss) maksan mikrosomeja tai S9-fraktioita, in vitro. Työn ensitavoitteena oli tutkia kalan CYP-entsyymien alttiutta lääkejäämien aiheuttamalle inhibitiolle. Tulosten perusteella EROD (CYP1A) -aktiivisuus oli erittäin altis lääkeaineiden laajalle inhibitiolle in vitro, ja BFCOD (CYP3A) -aktiivisuus oli vähemmän altis (I-III). Kalojen ja ihmisten CYP1A-entsyymin substraattiselektiivisyys erosi suuresti, joten suora vertailu lajien välillä ei liene mahdollista. Tulokset myös paljastivat, että yksittäisten lääkeaineiden inhibitiota aiheuttavat pitoisuudet olivat kertaluokkia suurempia kuin niiden villikaloista mitatut plasmapitoisuudet, ja että seoksina lääkeaineet voivat aiheuttaa synergististä CYP-inhibitiota kaloissa, pienilläkin pitoisuuksilla (I). Toisena tavoitteena oli tutkia CYP-inhibition vaikutusta lääkeaineiden hepaattiseen eliminaatioon kaloissa in vitro. Tässä yhteydessä määritettiin maksan ominaispuhdistumaa OECD 319B -testin ohjeiden mukaisesti, biokonsentroitumistekijän ekstrapolointia ja bioakkumulaatioriskin arviointia varten (III). CYP-inhibitiokokeiden tulokset osoittivat, että joidenkin lääkeaineiden inhibitio on ajasta riippuvaista (I-III), mikä usein viittaa palautumattomaan CYP-välitysketjun inaktivaatioon. Tästä syystä, myös uusi mikrofluidistinen menetelmä kehitettiin suoraviivaistamaan palautuvien ja palautumattomien entsyymi-inhibiittorien eriyttämistä toisistaan (IV). Tämä menetelmä validointiin ihmisen maksamikrosomeilla, sillä CYP-inhibitiomekanismit ovat tunnettuja ihmisessä, muttei kaloissa

Evaluation of the Stability of Cytochrome P450 immobilized enzyme microreactors

Cytochrome P450 (CYP) enzymes are important catalysers in the first phase of drug metabolism. Roughly two thirds of drugs are oxidized via CYP enzymes, which enable the further modification of drugs, and their excretion. In this thesis, human liver microsomes containing the main hepatic CYP enzymes were immobilized on thiol-ene based micropillar arrays and their stability was evaluated using a CYP2C9 isoenzyme specific luminescent substrate, Luciferin-H. The aim of the study was to develop microfluidic immobilized enzyme reactors (IMERs) for studying enzyme kinetics and drug-drug interactions. For this purpose, the instability issues associated with previously reported CYP-IMERs were carefully addressed. The CYP immobilization protocol used was based on a protocol previously developed in the context of other research projects and relied on biotinylation of human liver microsomes (HLM) with help of fusogenic liposomes. The biotinylated HLMs were then attached to the streptavidin-modified thiol-ene surfaces. The CYP activity was determined by utilizing microfluidics under continuous flow conditions (typically 5 μL/min) in the presence of NADPH. The luminescent metabolite formed by the CYP2C9 enzymes was quantified with a commercial well-plate reader from fractions collected at the microreactor outlet. Half-life was used to compare the differences between enzyme stabilities reached via different immobilization conditions. The effects of flow rate and reaction temperature on the stability of the CYP-IMERs was evaluated together with addition of antioxidative agents and reactive oxygen species (ROS) scavengers. Different functionalization steps as well as storage time and conditions were studied. With Luciferin-H as the model substrate of CYP2C9, the CYP-IMERs showed higher activity and stability at room temperature than at +37 °C. The peak activity could be increased via optimization of the immobilization protocol, though long-term storage diminished the peak activity. The activity of the IMERs typically attenuated within 1-2 hours with little or no improvement achieved via optimization of the immobilization or operation conditions. Only upon addition of the ROS scavengers, the peak activity and stability of the CYP-IMERs could be slightly improved. After functionalization, the IMERs maintained their activity until the time of use when stored in +4 °C for up to 2 weeks, but re-use of IMERs was not possible.Sytokromi P450 -entsyymit ovat tärkeitä katalysoijia lääkeainemetabolian ensimmäisessä vaiheessa. Noin kaksi kolmesta lääkeaineesta hapettuu CYP-entsyymien reaktioiden kautta, jotka mahdollistavat lääkeaineiden jatkofunktionalisoinnin ja niiden erittymisen elimistöstä. Tässä työssä sytokromi-P450 entsyymiä immobilisointiin tioleenista valmistettuihin mikropilarisiruihin ja arvioitiin entsyymien stabiiliutta käyttäen CYP2C9 -isoentsyymille spesifistä substraattia, Luciferin H:ta. Työn tarkoituksena oli kehittää immobilisoitujen entsyymien mikroreaktoreita (engl., immobilized enzyme reactor, IMER) entsyymikinetiikan ja lääke-lääke -interaktioiden tutkimiseen. Tätä tarkoitusta varten käisteltiin aiemmin kehitettyjen CYP-IMER:ien stabiiliuskysymyksiä. CYP-entsyymien immobilisointiprotokolla perustui aiempien tutkimusten yhteydessä kehitettyyn käytäntöön, jossa hyödynnettiin humaanimaksamikrosomien (engl. Human liver microsomes, HLM) biotinylointiin fuusiogeenisten liposomien avulla. Nämä kiinnitettiin streptavidiinilla funktionalisoituun tioleenipintaan. CYP-aktiivisuus määriteltin NADPH:n läsnäollessa mikrofluidistiikkaa hyödyntäen jatkuvan virtauksen olosuhteissa (tyypillisesti 5 µL/min). CYP2C9 -entsyymin tuottamaa luminesoivaa metaboliittia kvantitoitiin kaupallisella luminometrillä mikroreaktorin ulostuloaukosta kerätyistä fraktioista. Erilaisten immobilisaatio-olosuhteiden tuottaman stabiiliuden vertailua varten käytettiin CYP-entsyymien aktiivisuuden puoliintumisaikaa. CYP-IMER:en stabiiliutta verrattiin virtausnopeuden ja reaktiolämpötilan vaikutusten kautta sekä antioksidatiivisten että happiradikaalien muodostumista estävien aineiden (engl. reactive oxygen species, ROS scavengers) avulla. Eri funktionalisointivaiheiden, säilytysajan ja -olosuhteiden vaikutusta tutkittiin. CYP2C9-mallisubstraatin, Luciferin-H:n, avulla CYP-IMER:t tuottivat korkeamman aktiivisuuden huoneenlämmössä kuin +37 °C lämpötilassa. Lähtöaktiivisuutta voitiin kasvattaa immobilisointiprotokollan optimoinnin avulla, mutta pitkäaikainen säilytys pienensi sitä. IMER:en aktiivisuus vaimeni tyypillisesti 1-2 tunnin sisällä, vaikka pientä tai olematonta parannusta saatiin immobilisoinnin ja käytön aikaisella optimoinnilla. Ainoastaan happiradikaalien muodostumista estävien aineiden lisäyksellä CYP-IMER:en lähtöaktiivisuutta ja stabiiliutta saatiin hieman parannettua. Funktionalisoinnin jälkeen IMER:t säilyttivät aktiivisuutensa käyttöön asti, mikäli niitä säilytettiin +4 °C:ssa enimmillään kaksi viikkoa, mutta IMER:en uudelleenkäyttö ei ollut mahdollista

VIP score -mittari perifeerisen kanyylin arvioinnin apuvälineenä – perehdytysmateriaali hoitohenkilökunnalle

Ääreislaskimokatetrit ovat sairaaloiden yleisimmin käytettyjä invasiivisia välineitä. Kanyloinnin komplikaationa esiintyy usein flebiitti eli pinnallinen laskimotulehdus. Kanyylit ovat alttiita infektioille, sillä kanyyli avaa yhteyden verenkierron ja ympäristön mikrobien välille. Flebiitin oireita ovat kipu, punoitus, turvotus ja kuumotus. Tärkeimmät keinot sen ehkäisyyn ovat aseptinen toiminta, katetrin tarpeen päivittäinen arviointi ja tarpeettomien katetrien poisto. VIP score -mittari on standardoitu, tutkitusti toimivaksi osoitettu mittari, jota käytetään perifeerisen kanyylin juuren ihon kunnon tarkkailussa ja flebiitin tunnistamisessa. Mittari antaa numeerisen arvon juuren ihon kunnolle ja tarvittavat toimintaohjeet jokaista arvoa kohden. VIP score -mittaria tulee käyttää säännöllisesti ja havainnot kirjata potilastietojärjestelmään. Mittari edistää tutkitusti potilasturvallisuutta. Opinnäytetyön tarkoituksena oli tuottaa perehdytysmateriaali VIP score -mittarin käytöstä Varsinais-Suomen sairaanhoitopiirin Tyks Medisiinisen toimialueen käyttöön. Opinnäytetyön tavoitteena on edistää VIP score -mittarin käyttöä osana hoitoprotokollaa, parantaa potilasturvallisuutta, tehostaa infektioiden torjuntaa ja lisätä hoitohenkilökunnan ammatillista osaamista. Opinnäytetyö toteutettiin projektina, jonka tuotoksena valmistui perehdytysmateriaalina käytettävä diasarja. Se esitettiin toimeksiantajan kutsumalle kohderyhmälle. Toimeksiantajan kanssa tehtiin yhteistyötä koko projektin ajan sen varmistamiseksi, että työstä tulee tarkoituksenmukainen. Opinnäytetyössä noudatettiin eettisesti hyväksyttäviä ja luotettavia toimintatapoja. Tämän opinnäytetyön tuotoksena tehtyä perehdytysmateriaalia käytetään VIP score -mittarin jalkauttamisessa osastoille. Jatkotutkimusehdotukseksi työssä esitetään tutkimusta VIP score - mittarin käyttöönotosta ja käyttökokemuksista. Näin saataisiin tietoa mittarin hyödyistä ja konkreettisista vaikutuksista hoitotyöhön

HLM chip – A microfluidic approach to study the mechanistic basis of cytochrome P450 inhibition using immobilized human liver microsomes

Peer reviewe