Mécanismes d'action des androgènes sur l'expression des récepteurs de la famille du récepteur à l'EGF dans les cellules cancéreuses prostatiques : implication dans l'évolution des tumeurs vers l'hormono-indépendance. Mots-clés

La dépendance de la croissance des tumeurs prostatiques vis-à-vis des androgènes est mise à profit pour traiter les cancers diagnostiqués à un stade avancé. L’ablation androgénique entraine inévitablement l’apparition de cancers résistants à la thérapie antihormonale. Dans ces cancers, la signalisation du récepteur aux androgènes (RA) semble réactivée par différents mécanismes, en dépit de la concentration sérique réduite en androgènes. A coté de la signalisation androgénique, la signalisation induite par les récepteurs de la famille du REGF (encore appelée famille ERBB) est impliquée dans la prolifération, la survie, l’invasion et l’angiogenèse du cancer de la prostate. Ces récepteurs sont aussi capables de se substituer aux androgènes pour activer le RA. Des résultats antérieurs obtenus par d’autres équipes ont montré que les androgènes régulaient l’expression du REGF et d’ERBB2 dans les cellules cancéreuses prostatiques, sans préciser à quel(s) niveau(x) s’effectue cette régulation. Le but de ce travail est de déterminer par quels mécanismes les androgènes agissent pour contrôler l’expression des récepteurs ERBB1-3 dans des lignées cancéreuses prostatiques présentant différentes sensibilités aux androgènes, à savoir les cellules LNCaP dont la prolifération est androgéno-dépendante et les cellules 22Rv1 dont la prolifération est androgéno-indépendante. En plus du RA, les cellules 22Rv1 expriment un RA dépourvu du domaine carboxy-terminal contenant le domaine de liaison à l’hormone (RAΔCTD) et dont l’origine et la fonction n’étaient pas connues. Dans les cellules LNCaP, nous avons montré que le RA activé par la dihydrotestostérone (DHT) stimule le taux des transcrits et des protéines REGF et répriment ceux d’ERBB2 en agissant à un niveau transcriptionnel. La DHT n’influence pas les taux d’ERBB3. Dans les cellules 22Rv1, la DHT n’influence pas les taux du REGF et d’ERBB2 ni le taux des transcrits de trois gènes endogènes androgéno-sensibles que nous avons testés. A l’aide de siRNA dirigés contre la région codant le domaine amino-terminal (NTD) ou carboxy-terminal du RA, nous avons montré que le RAΔCTD résulte de la présence de transcrit différent de celui codant la forme longue. La capacité de ces siRNA à éteindre l’expression de la forme longue, ou de la forme longue et de la forme courte du RA, nous a permis d’étudier la contribution des deux isoformes à réguler l’expression de gènes et la viabilité des cellules 22Rv1. Nous avons ainsi montré que la présence du RAΔCTD contrôle le taux des protéines REGF et ERBB2 à un niveau post-transcriptionnel. De plus, le RAΔCTD et dans une moindre mesure, le RA contribuent à l’expression des trois gènes androgéno-sensibles endogènes testés et à la viabilité des cellules 22Rv1 cultivées dans un milieu appauvri en stéroïdes. Une inhibition plus importante de la viabilité cellulaire était observée en présence d’un inhibiteur tyrosine kinase des récepteurs.En conclusion, notre étude montre que différents mécanismes régulés par les androgènes ou leurs récepteurs contrôlent l’expression du REGF et d’ERBB2 dans des cellules présentant différentes sensibilités aux androgènes. Nous avons par ailleurs identifié le RAΔCTD comme un régulateur important du phénotype hormono-réfractaire des cellules 22Rv1. Des études complémentaires devront déterminer si la participation du RAΔCTD à la viabilité des cellules 22Rv1 passe par la régulation de l’expression du REGF ou d’ERBB2. De plus, si l’expression du RAΔCTD venait à se confirmer dans les cancers de la prostate, le développement de nouvelles thérapies ciblant le domaine NTD ou l’expression du RA constituerait une alternative intéressante aux thérapies actuelles dirigées contre le CTD

Ku proteins interact with activator protein-2 transcription factors and contribute to ERBB2 overexpression in breast cancer cell lines

INTRODUCTION: Activator protein-2 (AP-2) alpha and AP-2 gamma transcription factors contribute to ERBB2 gene overexpression in breast cancer. In order to understand the mechanism by which the ERBB2 gene is overexpressed we searched for novel AP-2 interacting factors that contribute to its activity. METHODS: Ku proteins were identified as AP-2 alpha interacting proteins by glutathione serine transferase (GST)-pull down followed by mass spectrometry. Transfection of the cells with siRNA, expression vectors and reporter vectors as well as chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay were used to ascertain the implication of Ku proteins on ERBB2 expression. RESULTS: Nuclear proteins from BT-474 cells overexpressing AP-2 alpha and AP-2 gamma were incubated with GST-AP2 or GST coated beads. Among the proteins retained specifically on GST-AP2 coated beads Ku70 and Ku80 proteins were identified by mass spectrometry. The contribution of Ku proteins to ERBB2 gene expression in BT-474 and SKBR3 cell lines was investigated by downregulating Ku proteins through the use of specific siRNAs. Depletion of Ku proteins led to downregulation of ERBB2 mRNA and protein levels. Furthermore, reduction of Ku80 in HCT116 cell line decreased the AP-2 alpha activity on a reporter vector containing an AP-2 binding site linked to the ERBB2 core promoter, and transfection of Ku80 increased the activity of AP-2 alpha on this promoter. Ku siRNAs also inhibited the activity of this reporter vector in BT-474 and SKBR3 cell lines and the activity of the ERBB2 promoter was further reduced by combining Ku siRNAs with AP-2 alpha and AP-2 gamma siRNAs. ChIP experiments with chromatin extracted from wild type or AP-2 alpha and AP-2 gamma or Ku70 siRNA transfected BT-474 cells demonstrated Ku70 recruitment to the ERBB2 proximal promoter in association with AP-2 alpha and AP-2 gamma. Moreover, Ku70 siRNA like AP-2 siRNAs, greatly reduced PolII recruitment to the ERBB2 proximal promoter. CONCLUSIONS: Ku proteins in interaction with AP-2 (alpha and gamma) contribute to increased ERBB2 mRNA and protein levels in breast cancer cells

Androgen receptor controls EGFR and ERBB2 gene expression at different levels in prostate cancer cell lines.

EGFR or ERBB2 contributes to prostate cancer (PCa) progression by activating the androgen receptor (AR) in hormone-poor conditions. Here, we investigated the mechanisms by which androgens regulate EGFR and ERBB2 expression in PCa cells. In steroid-depleted medium (SDM), EGFR protein was less abundant in androgen-sensitive LNCaP than in androgen ablation-resistant 22Rv1 cells, whereas transcript levels were similar. Dihydrotestosterone (DHT) treatment increased both EGFR mRNA and protein levels and stimulated RNA polymerase II recruitment to the EGFR gene promoter, whereas it decreased ERBB2 transcript and protein levels in LNCaP cells. DHT altered neither EGFR or ERBB2 levels nor the abundance of prostate-specific antigen (PSA), TMEPA1, or TMPRSS2 mRNAs in 22Rv1 cells, which express the full-length and a shorter AR isoform deleted from the COOH-terminal domain (ARDeltaCTD). The contribution of both AR isoforms to the expression of these genes was assessed by small interfering RNAs targeting only the full-length or both AR isoforms. Silencing of both isoforms strongly reduced PSA, TMEPA1, and TMPRSS2 transcript levels. Inhibition of both AR isoforms did not affect EGFR and ERBB2 transcript levels but decreased EGFR and increased ERBB2 protein levels. Proliferation of 22Rv1 cells in SDM was inhibited in the absence of AR and ARDeltaCTD. A further decrease was obtained with PKI166, an EGFR/ERBB2 kinase inhibitor. Overall, we showed that ARDeltaCTD is responsible for constitutive EGFR expression and ERBB2 repression in 22Rv1 cells and that ARDeltaCTD and tyrosine kinase receptors are necessary for sustained 22Rv1 cell growth

Regulation by androgens of EGF receptor family members in prostate cancer cells

peer reviewedAfter an initial positive response to anti-androgen treatment, prostate cancer (PCa) cells usually become hormone-refractory in spite of their persistent expression of the androgen receptor (AR). Overexpression of tyrosine kinase receptors in androgen-deprived PCa cells, such as those of the EGF receptor (EGFR) family, may be responsible for AR activation and growth of androgen-deprived tumours. Our goal is to understand the control of the expression of the EGFR family members by androgens in PCa. Hormone response was compared in hormone-sensitive LNCaP and hormone-insensitive DU145 PCa cell lines. These cells do not express ErbB4. EGFR, erbB2 and erbB3 protein half-life is much longer in DU145 than in LNCaP cells grown in complete medium. Dihydrotestosterone (DHT) modulates EGFR and erbB2 transcript and protein levels only in LNCaP cells. ErbB3 is not an androgen-responsive gene. EGFR mRNA and protein levels are increased while erbB2 mRNA and protein levels are decreased after DHT treatment of cells cultured in steroid-deprived medium. ErbB2 mRNA and protein levels are increased in LNCaP cells following DHT withdrawal. In order to understand the mechanisms by which androgens control the expression of EGFR and ERBB2 genes, half lifes of the corresponding mRNAs and proteins were compared in cells grown in presence or absence of DHT. The effect of DHT on EGFR gene expression is complex. Indeed, DHT stabilizes the protein. Moreover, a superinduction of EGFR mRNA was observed in cells treated with cycloheximide (CHX) before addition of the hormone, suggesting an effect on transcript stability. In contrast, erbB2 mRNA and protein stability was not affected by DHT. CHX treatment for 2h before addition of DHT suppresses the androgen-induced down-regulation of erbB2 mRNA levels. In summary, androgen-mediated regulation of EGFR and ERBB2 genes expression is complex. DHT influences EGFR gene transcription, mRNA and protein stability. DHT does not affect erbB2 mRNA and protein stability but acts indirectly on transcription. Current experiments are undertaken to verify these observations by Chromatin-IP experiments on both genes promoters