Rabies virus nucleoprotein: Large-scale expression in prokaryotic system

Rabies is controlled by mass animal vaccination campaigns. Cats, dogs, and wild animals (e.g., bats) are large reservoirs of this virus and can pose a significant threat to the human health, especially in the developing countries. The nucleoprotein of the rabies virus is of great scientific interest since it has the potential to generate immunity in animals and can be used as for immunochemical diagnostics. The study aimed to test a large-scale expression of the rabies N protein in a prokaryotic system. The recombinant N protein was successfully expressed and purified. It was immunologically recognized by specific antibodies and was able to induce the production of specific antibodies in a mouse immunization assay. These encouraging results indicate that the recombinant N protein can be evaluated as an antigen for the development of a subunit vaccine or for a diagnostic assay.Fil: Picotto, Leandro Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Panei, Carlos Javier. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Microbiología. Cátedra de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Pecoraro, Marcelo Ricardo. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Microbiología. Cátedra de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Sguazza, Guillermo Hernán. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Microbiología. Cátedra de Virología; Argentin

The cloning of the virus envelope glycoprotein F of canine distemper virus expressed in Pichia pastoris

Canine distemper virus (CDV) is a pathogen which affects members of the Canidae family, causing an acute, often fatal, systemic disease. CDV is an RNA virus of the family Paramyxoviridae that contains two envelope glycoproteins: F and HA. In this study, we focused on the envelope glycoprotein F as the main target for neutralizing antibodies produced after infection or vaccination. The complete coding region of the protein (60 kDa) was expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, obtained in a recombinant form and secreted to the culture medium. Later, to analyze its immunogenicity, the protein was combined with an oily adjuvant and used to inoculate mice. The results provide evidence supporting a potential application of this recombinant protein as a subunit vaccine.Fil: Tizzano, Marco Antonio. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias; ArgentinaFil: Sguazza, Guillermo Hernán. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias; ArgentinaFil: Picotto, Leandro Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias; ArgentinaFil: Echeverria, Maria Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias; ArgentinaFil: Pecoraro, Marcelo Ricardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentin

Development of an immunodiffusion technique for the detection of Sacbrood bee virus

La apicultura es una de las actividades agrícolas más importantes de la República Argentina. En los últimos años se ha observado, a nivel mundial, una marcada disminución en el número de abejas. La mortalidad de las abejas, puede atribuirse a la interacción de factores ambientales, al manejo de las colonias o a la acción de diversos microorganismos, entre ellos los virus. Teniendo en cuenta que en la Argentina en este momento solamente se cuenta con técnicas de diagnostico moleculares para la detección de virus, el objetivo de este trabajo fue desarrollar un test de inmunodifusión que permita la detección del Virus de la Cría Ensacada de forma más sencilla y económica. Para ello una cepa autóctona del virus Virus de la Cría Ensacada fue utilizada para inocular un conejo a partir del cual se obtuvieron anticuerpos específicos contra este virus, que posteriormente fueron utilizados para estandarizar la técnica de inmuodifusión. Esta técnica podría ser de gran utilidad en el futuro para realizar un relevamiento rápido de las condiciones sanitarias para SBV en colmenas de la República Argentina ya que debido a su baja complejidad podría ser llevada a cabo en laboratorios de baja complejidad de todo el país.Beekeeping is one of the most important agricultural activities in Argentine.In recent years, there has been a decrease in the number of bees worldwide. The mortality of bees can be attributed to several factors, such as the interaction of environmental factors, wrong management of colonies or the action of various patognes, including viruses. Considering that in Argentina, only molecular diagnostic techniques are available for the detection of viruses, the objective of this work was to develop an immunodiffusion test that allows the detection of the sacbrood bee virus as a simpler and Economical alternative. To developed the immunodiffusion test we use an indigenous virus strain of sacbrood was used to inoculate a rabbit from which specific antibodies were obtained against this virus. Later were used to standardize the immuodiffusion technique. This technique could be very useful in the future to carry out a rapid survey of the sanitary conditions for SBV in hives of Argentine, because due to its low complexity it could be carried out in laboratories of low complexity throughout the country.Laboratorio de VirologíaFacultad de Ciencias Agrarias y Forestale

Development of an immunodiffusion technique for the detection of Sacbrood bee virus

La apicultura es una de las actividades agrícolas más importantes de la República Argentina.En los últimos años se ha observado, a nivel mundial, una marcada disminución en el númerode abejas. La mortalidad de las abejas, puede atribuirse a la interacción de factores ambientales,al manejo de las colonias o a la acción de diversos microorganismos, entre ellos los virus.Teniendo en cuenta que en la Argentina en este momento solamente se cuenta con técnicas dediagnostico moleculares para la detección de virus, el objetivo de este trabajo fue desarrollarun test de inmunodifusión que permita la detección del Virus de la Cría Ensacada de formamás sencilla y económica.Para ello una cepa autóctona del virus Virus de la Cría Ensacada fue utilizada para inocular unconejo a partir del cual se obtuvieron anticuerpos específicos contra este virus, que posteriormentefueron utilizados para estandarizar la técnica de inmuodifusión. Esta técnica podría ser de granutilidad en el futuro para realizar un relevamiento rápido de las condiciones sanitarias para SBVen colmenas de la República Argentina ya que debido a su baja complejidad podría ser llevadaa cabo en laboratorios de baja complejidad de todo el país.Beekeeping is one of the most important agricultural activities in Argentine.In recent years, there has been a decrease in the number of bees worldwide. The mortality of bees can be attributed to several factors, such as the interaction of environmental factors, wrong management of colonies or the action of various patognes, including viruses. Considering that in Argentina, only molecular diagnostic techniques are available for the detection of viruses, the objective of this work was to develop an immunodiffusion test that allows the detection of the sacbrood bee virus as a simpler and Economical alternative. To developed the immunodiffusion test we use an indigenous virus strain of sacbrood was used to inoculate a rabbit from which specific antibodies were obtained against this virus. Later were used to standardize the immuodiffusion technique. This technique could be very useful in the future to carry out a rapid survey of the sanitary conditions for SBV in hives of Argentine, because due to its low complexity it could be carried out in laboratories of low complexity throughout the country.Fil: Albo, Graciela Noemí. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Kuzmanich, R.. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales; ArgentinaFil: Reynaldi, Francisco José. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Microbiología. Cátedra de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; ArgentinaFil: Picotto, Leandro Daniel. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Microbiología. Cátedra de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Sguazza, Guillermo Hernán. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Microbiología. Cátedra de Virología; Argentin

The cloning of the virus envelope glycoprotein F of canine distemper virus expressed in Pichia pastoris

Canine distemper virus (CDV) is a pathogen which affects members of the Canidae family, causing an acute, often fatal, systemic disease. CDV is an RNA virus of the family Paramyxoviridae that contains two envelope glycoproteins: F and HA. In this study, we focused on the envelope glycoprotein F as the main target for neutralizing antibodies produced after infection or vaccination. The complete coding region of the protein (60 kDa) was expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris, obtained in a recombinant form and secreted to the culture medium. Later, to analyze its immunogenicity, the protein was combined with an oily adjuvant and used to inoculate mice. The results provide evidence supporting a potential application of this recombinant protein as a subunit vaccine.Facultad de Ciencias Veterinaria

Expresión de la proteína de la cápside del virus de la artritis encefalitis caprina en <i>Pichia pastoris</i> para su uso como antígeno diagnóstico

Los lentivirus de pequeños rumiantes (SRLV), como el virus de Maedi-Visna (MVV) y el virus de la artritis-encefalitis caprina (CAEV), pertenecen a la familia Retroviridae. Estos retrovirus producen inflamaciones crónicas y enfermedades multisistémicas de denuncia obligatoria en Argentina. El genoma del CAEV posee genes estructurales denominados gag, pol y env. El gen gag codifica para una poliproteína que se cliva en las proteínas de cápside (CA), de nucleocápside (NC) y de matriz (MA). La proteína CA presenta epítopes inmunodominantes que inducen una fuerte respuesta inmunológica y es utilizada en la elaboración de equipos de diagnóstico contra SRLV. Las mutaciones encontradas en estos epítopes son un inconveniente en la detección de la enfermedad, por lo que el desarrollo de equipos diagnósticos utilizando cepas que circulan en una región determinada es de crucial importancia para un diagnóstico confiable. Debido a que no existen equipos de diagnóstico comerciales elaborados en Argentina, los equipos utilizados son importados y de un alto valor económico. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue expresar la proteína CA del CAEV para su uso como antígeno diagnóstico.Trabajo publicado en Cagliada, Maria del Pilar Lilia y Galosi, Cecilia Mónica (comps.). I Congreso de Microbiología Veterinaria. Libro de resúmenes. La Plata: Facultad de Ciencias Veterinarias, 2021.Facultad de Ciencias Veterinaria

An effective and simplified DO-stat control strategy for production of rabies glycoprotein in Pichia pastoris

The glycoprotein (G-protein) of rabies virus is responsible for viral attachment to the host cell surface and induces virus neutralization antibodies. In the present study, the G-protein gene of rabies virus CVS strain was cloned, sequenced and expressed in the yeast, Pichia pastoris, as a secreted protein, using a simplified DO-stat control feeding strategy. This strategy involves the addition of methanol when the dissolved oxygen (DO) level rises above the setpoint avoiding methanol accumulation and oxygen limitation. The G-protein expression was evaluated by SDS-PAGE, ELISA, and western blot assays. Like native G-protein, the recombinant G-protein was found reactive when it was challenged against specific antibodies. The data indicate that the recombinant G-protein can be easily expressed and isolated, and may be useful as a safe source in the production of diagnostic kits and subunit vaccines to prevent rabies.Facultad de Ciencias VeterinariasCentro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriale

Biotechnological processes development for heterologous production of rabies proteins for its use in veterinary medicine

El virus de la rabia causa una forma letal de encefalomielitis tanto en seres humanos como en animales. El control de la rabia canina, mediante programas de vacunación masiva y eliminación de los perros callejeros, puede reducir la incidencia de la rabia en humanos. En Argentina, las campañas de vacunación utilizan vacunas producidas en cerebro de ratones lactantes, pero la producción de estas vacunas involucra la manipulación del virus activo y es costosa; además, ha sido desaconsejada por la Organización Mundial de la Salud. Debido a que la rabia afecta, principalmente, países en desarrollo, es necesaria una solución económica. En este contexto, se estudió la producción recombinante de las proteínas más inmunogénicas del virus de la rabia: la glicoproteína y la nucleoproteína, en bacterias y levaduras, como alternativa al método actual de producción. Estos sistemas de expresión fueron seleccionados debido a las ventajas técnicas que presentan: fácil manipulación, altos niveles de expresión de proteínas y relativa sencillez para escalar. Los resultados encontrados indican que las proteínas recombinantes obtenidas se expresaron y purificaron de manera sencilla, pudiendo ser usadas como fuente segura de antígeno en la producción de una vacuna a subunidades, para la prevención de la enfermedad. La inmunogenicidad de las proteínas recombinantes fue evaluada mediante el ensayo de potencia del NIH, pero no se logró generar protección en los ratones. Sin embargo, las proteínas recombinantes fueron capaces de producir anticuerpos específicos contra las proteínas nativas del virus, aunque en un título menor al necesario para generar protección ante un desafío viral. Estos resultados son alentadores con vistas al futuro, debido a que mediante nuevos estudios, incrementando las concentraciones de antígenos y utilizando otros adyuvantes, sería posible alcanzar títulos de anticuerpos específicos a la rabia capaces de producir protección ante un desafío viral.The rabies virus causes a lethal form of encephalomyelitis in both humans and animals. The control of canine rabies, through vaccination programs and eliminating stray dogs can reduce the incidence of human rabies. In Argentina, vaccination campaigns use vaccines produced in the brain of suckling mice. Production of this vaccine involves handling live virus and is expensive. In addition, it has been discouraged by the World Health Organization. Rabies is a worldwide disease which mainly affects developing countries. Thus, an efficient and affordable solution is needed. In this context, the production of the most immunogenic proteins of rabies virus (the glycoprotein and the nucleoprotein) was studied in bacteria and yeasts, as an alternative to the current vaccine production method. These expression systems were selected due to the technical advantages they present: easy handling, high levels of protein expression and relative simplicity to scale. Results show that the recombinant rabies proteins were expressed and purified easily, and can be used as a safe source of antigen in the production of a subunit vaccine, for the prevention of the disease. The immunogenicity of the recombinant proteins was assessed by the NIH potency assay, but protection was not achieved in the mice. However, the recombinant proteins 6 were able to produce specific antibodies against the native proteins of the virus, although in a lower titer than necessary to generate protection against a viral challenge. These results are encouraging for the future, because through new studies, by increasing antigen concentrations or with the use of other adjutants, it would be possible to reach specific titers of antibodies against rabies capable of producing protection against a viral challenge.Fil: Picotto, Leandro Daniel. Autor; . Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; Argentin

Production of Rabies Virus Glycoprotein G in <i>Pichia pastoris</i> Yeast for Its Use in Veterinary Medicine

El gen de la glicoproteína G de la cepa CVS-51 del virus de rabia fue clonado, secuenciado y expresado en la levadura Pichia pastoris como proteína de secreción. La antigenicidad de esta proteína recombinante fue analizada preliminarmente mediante Western blot. La glicoproteína recombinante mostró reaccionar de la misma manera que la glicoproteína nativa cuando se la enfrentó a anticuerpos específicos. Los datos indican que la glicoproteína recombinante puede ser expresada y aislada de manera sencilla y podría ser usada como fuente segura de antígeno en la producción de sistemas aplicados al diagnóstico y de una vacuna a subunidades para la prevención de la enfermedad.The Glycoprotein (G) gene of rabies virus CVS-51 strain was cloned, sequenced and expressed in Pichia pastoris yeast as a secreted protein. The antigenicity of this recombinant protein was preliminarily examined by Western blot. Like native glycoprotein, the recombinant glycoprotein was found reactive when challenged against specific antibodies. The data indicate that the recombinant protein can be expressed and isolated straightforwardly and may be useful as a safe source in the production of diagnostic kits and subunit vaccines to prevent the disease.Facultad de Ciencias Veterinaria

An effective and simplified DO-stat control strategy for production of rabies glycoprotein in Pichia pastoris

The glycoprotein (G-protein) of rabies virus is responsible for viral attachment to the host cell surface and induces virus neutralization antibodies. In the present study, the G-protein gene of rabies virus CVS strain was cloned, sequenced and expressed in the yeast, Pichia pastoris, as a secreted protein, using a simplified DO-stat control feeding strategy. This strategy involves the addition of methanol when the dissolved oxygen (DO) level rises above the setpoint avoiding methanol accumulation and oxygen limitation. The G-protein expression was evaluated by SDS-PAGE, ELISA, and western blot assays. Like native G-protein, the recombinant G-protein was found reactive when it was challenged against specific antibodies. The data indicate that the recombinant G-protein can be easily expressed and isolated, and may be useful as a safe source in the production of diagnostic kits and subunit vaccines to prevent rabies.Fil: Picotto, Leandro Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Sguazza, Guillermo Hernán. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Microbiología. Cátedra de Virología; ArgentinaFil: Tizzano, Marco Antonio. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Microbiología. Cátedra de Virología; ArgentinaFil: Galosi, Cecilia Monica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Microbiología. Cátedra de Virología; ArgentinaFil: Cavalitto, Sebastian Fernando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; ArgentinaFil: Pecoraro, Marcelo Ricardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias. Departamento de Microbiología. Cátedra de Virología; Argentin