Neurotensin Receptor 1 Is Expressed in Gastrointestinal Stromal Tumors but Not in Interstitial Cells of Cajal

Gastrointestinal stromal tumors (GIST) are thought to derive from the interstitial cells of Cajal (ICC) or an ICC precursor. Oncogenic mutations of the KIT or PDGFRA receptor tyrosine kinases are present in the majority of GIST, leading to ligand-independent activation of the intracellular signal transduction pathways. We previously investigated the gene expression profile in the murine KitK641E GIST model and identified Ntsr1 mRNA, encoding the Neurotensin receptor 1, amongst the upregulated genes. Here we characterized Ntsr1 mRNA and protein expression in the murine KitK641E GIST model and in tissue microarrays of human GIST. Ntsr1 mRNA upregulation in KitK641E animals was confirmed by quantitative PCR. Ntsr1 immunoreactivity was not detected in the Kit positive ICC of WT mice, but was present in the Kit positive hyperplasia of KitK641E mice. In the normal human gut, NTSR1 immunoreactivity was detected in myenteric neurons but not in KIT positive ICC. Two independent tissue microarrays, including a total of 97 GIST, revealed NTSR1 immunoreactivity in all specimens, including the KIT negative GIST with PDGFRA mutation. NTSR1 immunoreactivity exhibited nuclear, cytoplasmic or mixed patterns, which might relate to variable levels of NTSR1 activation. As studies using radio-labeled NTSR1 ligand analogues for whole body tumor imaging and for targeted therapeutic interventions have already been reported, this study opens new perspectives for similar approaches in GIST

Identification and validation of new markers and potential therapeutic targets for gastrointestinal stromal tumors in murine models and in human pathological material

Les tumeurs gastro-intestinales stromales (Gastro-Intestinal Stromal Tumours - GIST en Anglais) sont les sarcomes les plus fréquents du tube digestif. Sur base de leur profil d'expression génique et de similitudes morphologiques, il a été établi que les GIST dérivent des cellules interstitielles de Cajal (Interstitial Cells of Cajal - ICC en Anglais) ou d'un précurseur commun. Le développement et le maintient des ICC sont dépendant de voies de signalisation du récepteur tyrosine kinase KIT. Des mutations oncogéniques de KIT, conduisant indépendamment du ligand à l'activation des voies de signalisation en aval, sont présentes dans environ 85% des GIST. Depuis une dizaine d'années, des molécules de synthèse qui inhibent la phosphorylation -et donc l'activation - de KIT ont été introduites avec succès dans le traitement clinique des GIST. Cependant des résistances, souvent causées par des mutations secondaires, apparaissent fréquemment et environ 50% des patients traités rechutent dans les 2 ans. Le développement de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour les GIST demeure donc essentiel. Ces dernières années, de nouveaux marqueurs diagnostiques ou cibles thérapeutiques potentielles ont été rapportés dans la littérature (p.ex. Discovered on GIST-1 (DOG1, anoctamin 1), Protein kinase C theta (PKC theta), Carbonic anhydrase II (CAII)) .Il faut relever que tous ces gènes sont aussi exprimés par les ICC KIT+ du tube digestif normal et que leur présence dans les GIST reflète donc vraissemblablement essentiellement leur parenté avec les ICC.Dans la présente étude, nous nous sommes attachés à identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques ou cibles thérapeutiques potentielles exprimés par les GIST mais absent des ICC KIT+ normales.Pour ce faire, nous avons comparé le profile d'expression géniques de l'antre gastrique de souris porteuses de la mutation oncogénique Kit K641E et de souris contrôles (wild type WT en Anglais) par la technique de cDNA microarray. Les différences d'expression génique ont été ensuite confirmées par réactions de PCR quantitative (qPCR) en temps réel et l'immunoréactivité (-ir) pour les candidats les plus prometteurs a été localisée par immunofluorescence (IF) dans la muscularis propria du tube digestif, avec une attention spéciale pour les cellules KIT+.Plusieurs gènes identifiés appartenaient tant au profil d'expression génique des GIST qu'au profil d'expression des ICC Kit+ de l'intestin grêle murin, validant ainsi la pertinence du modèle murin KitK641E pour l'approche choisie (Chapitre 3). D'autre part, trois gènes identifiés (Neurotensin receptor 1 (Ntsr1), Trophoblast glycoprotein (Tpbg/5T) et Sprouty homolog 4 (Spry4)) étaient quant à eux présents dans la couche hypertrophié de cellules Kit+ de l'antre des souris KitK641E mais absentes des ICC Kit+ chez les souris WT (Chapitres 3, 4, 5). Ces gènes représentant donc de nouveaux candidats potentiels comme marqueurs spécifiques et/ou comme cibles thérapeutiques dans les GIST, nous avons, dans la seconde partie de notre travail, approfondi l'étude de leur expression et de leur régulation en utilisant des modèles cellulaires et tissulaires murins, ainsi que du matériel anatomopathologique de GIST humains.Dans le tube digestif normal, NTSR1 et TPBG/5T4 ir ont été identifiés dans les neurones myentériques mais pas dans les ICCKIT+. Deux "tissue arrays" indépendants, totalisants 97 spécimens humains de GIST, ont révélés la présence de NTSR1-ir dans tous les GIST, en ce compris les cas négatifs pour KIT, tandis que TPBG/5T4-ir était présente dans 36/49 GIST. Un fort immunomarquage pour TPBG/5T4 était statistiquement associée aux tumeurs malignes et de haut risque (Chapitre 5; Annexe 1).L'expression différentielle de membres de la famille des "Sprouty homologues" (Spry) dans l'antre des souris KitK641E a aussi été identifiée. Spry4-ir n'était pas détectable dans les ICC KIT+ des souris WT alors que Spry4-ir était présente dans la couche hyperplasique des cellules Kit+ chez les souris KitK641E. A l'opposé, l'ARN messager de Spry2 présentait un niveau d'expression similaire et Spry2-ir était détectée dans les cellules musculaires lisses - mais pas dans les cellules Kit+ - dans tous les génotypes (Chapitre 3). Pour sa part, l'expression de Spry1 apparaissait réprimée par le mutant oncogénique KitK641E, tant in vivo qu'in vitro, conduisant à la dérégulation de la boucle de rétrocontrôle négatif de la voie Ras/Erk (Chapitre 4). Dans la dernière partie de cette thèse, nous avons étudié l'expression Endoglin (ENG) - aussi connues sous le nom de CD105 – dans le modèle murin de GIST KitK641E, dans les GIST humains et dans le modèle cellulaire murin Ba/F3 in vitro. ENG est une glycoprotéine transmembraire et un composant auxiliaire du complexe du récepteur au TGF-&Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiquesinfo:eu-repo/semantics/nonPublishe

Abnormal elevated PTEN expression in the mouse antrum of a model of GIST Kit(K641E/K641E).

Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are the most common mesenchymal tumors of the gastrointestinal tract. Approximately 85% of GISTs harbor activating mutations of the KIT or PDGFRA receptor tyrosine kinases. PTEN and SHIP2 are major phosphatases that dephosphorylate PI(3,4,5)P(3), one of the intracellular signal pathways downstream of KIT. PTEN is an important tumor suppressor, whereas the involvement of SHIP2 in cancer has been proposed based essentially on cell line studies. We have used a mouse model of GIST, i.e. Kit(K641E) knock-in mice, resulting in the substitution of a Lys by Glu at position 641 of Kit. In homozygous Kit(K641E) mice, PTEN-immunoreactivity (ir) in antrum was found in the hyperplastic Kit-ir layer. The same localization was found for SHIP2. Western blot analysis in antrum showed a large increase in PTEN expression in Kit(K641E) homozygous mice as compared to wild type. In contrast, SHIP2 expression was not affected between the two genotypes. Erk1, but not PKB, phosphorylation appears to be upregulated in Kit(K641E) homozygous mice. In the human GIST882 imatinib sensitive cell line, both PTEN and SHIP2 were expressed and showed, in part, a nuclear localization. The upregulation of PTEN in antrum in Kit(K641E) mice might serve as a feedback mechanism to limit PI 3-kinase activation downstream of Kit in a context of oncogenic mutation.Journal ArticleSCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

ENDOGLIN/CD105 is expressed in KIT positive cells in the gut and in gastrointestinal stromal tumours.

ENDOGLIN/CD105 (ENG) is a transmembrane glycoprotein and an auxiliary unit of the transforming growth factor-β (TGF-β); receptor, expressed predominantly in vascular endothelium. Noteworthy, Eng mRNA expression has been reported also in Kit(+) interstitial cells of Cajal (ICC) in the mouse intestine. Gastrointestinal stromal tumours (GIST) are thought to derive from ICC. Here we have investigated Eng expression in the Kit(K641E) mouse GIST model, in human GIST and in the Ba/F3 cell model. In wild type (WT) mouse antrum, Eng immunoreactivity (-ir) was detected in CD34(+) /CD31(+) endothelium and in Kit(+) ICC. In Kit(K641E) mice, hyperplasia of Kit(+) cells made Eng-ir even more evident. Quantitative PCR confirmed the increased expression of Eng transcript in Kit(K641E) mice. On human GIST TMA, 26/49 cases stained positive for ENG. Strong ENG staining was associated with malignant and high-risk tumours. ENG negative cases were predominantly of the epithelioid type or harboured PDGFRA mutation. In vitro, Eng mRNA was up-regulated in Ba/F3 cell lines stably expressing various oncogenic Kit mutations (K641E, del559, del814). This effect appeared to be independent of Kit activation, as neither the stimulation of WT Kit by its ligand SCF, nor the inhibition of Kit autophosphorylation by imatinib mesylate in oncogenic mutants, altered Eng expression. Elevated Eng expression in Kit oncogenic mutants appeared rather to be indirectly mediated by DNA hypomethylation, because treatment with the demethylating agent 5-Aza/dC increased Eng mRNA expression in Kit(WT) cells. ENG expression in ICC and in GIST deserves further consideration as ENG is emerging as a potential target for cancer therapy.Journal ArticleResearch Support, Non-U.S. Gov'tSCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for both the maintenance of LTP and for synaptic capture

Expression of VP16-CREB, a constitutively active form of CREB, in hippocampal neurons of the CA1 region lowers the threshold for eliciting the late, persistent phase of long-term potentiation (L-LTP) in the Schaffer collateral pathway. This VP16-CREB-mediated L-LTP differs from the conventional late phase of LTP in not being dependent on new transcription. This finding suggests that in the transgenic mice the mRNA transcript(s) encoding the protein(s) necessary for this form of L-LTP might already be present in CA1 neurons in the basal condition. We used high-density oligonucleotide arrays to identify the mRNAs differentially expressed in the hippocampus of transgenic and wild-type mice. We then explored the contribution of the most prominent candidate genes revealed by our screening, namely prodynorphin, BDNF, and MHC class I molecules, to the facilitated LTP of VP16-CREB mice. We found that the overexpression of brain-derived neurotrophic factor accounts for an important component of this phenotype.A.B. was supported by a grant from the Hereditary Disease Foundation and is now supported, together with P.G., by the Marie Curie Excellence grant MEXT-CT-2003-509550. E.R.K is supported by Howard Hughes Medical Institute and by the G. Harold and Leila Y. Mathers Foundation.Peer reviewe

Muskelin regulates actin-dependent synaptic changes and intrinsic brain activity relevant to behavioral and cognitive processes

Muskelin (Mkln1) is implicated in neuronal function, regulating plasma membrane receptor trafficking. However, its influence on intrinsic brain activity and corresponding behavioral processes remains unclear. Here we show that murine Mkln1 knockout causes non-habituating locomotor activity, increased exploratory drive, and decreased locomotor response to amphetamine. Muskelin deficiency impairs social novelty detection while promoting the retention of spatial reference memory and fear extinction recall. This is strongly mirrored in either weaker or stronger resting-state functional connectivity between critical circuits mediating locomotor exploration and cognition. We show that Mkln1 deletion alters dendrite branching and spine structure, coinciding with enhanced AMPAR-mediated synaptic transmission but selective impairment in synaptic potentiation maintenance. We identify muskelin at excitatory synapses and highlight its role in regulating dendritic spine actin stability. Our findings point to aberrant spine actin modulation and changes in glutamatergic synaptic function as critical mechanisms that contribute to the neurobehavioral phenotype arising from Mkln1 ablation