El rol de cugbp1 en el desarrollo del cristalino del pez cebra

Proyecto de Graduación (Bachillerato en Ingeniería en Biotecnología) Instituto Tecnológico de Costa Rica, Escuela de Biología, 2012.The lens is a transparent tissue in the anterior of the eye and its main role is to refract light on the retina. The lens consists of two types of cells: epithelial cells and fibers. Epithelial cells surround the anterior and lateral limits of the lens, remain proliferative and at the equator of the lens they differentiate into lens fibers. In this process newly generated lens fibers elongate and gradually lose their organelles, enabling transparency. Cataracts are any opacification of the lens that compromises its ability to refract light onto the retina, and can be genetic or environmentally induced. Since it has been demonstrated that the zebrafish (Danio rerio) is an ideal organism to study human ocular disorders, this model system was utilized to study gene products that regulate normal lens development and that in pathological states contribute to cataracts. CUGBP1 is an mRNA binding protein that has been implicated in the multisystemic disease Myotonic Dystrophy 1 (DM1). DM1 is caused by a (CTG)n repeat expansion within the 3'UTR region of the DMPK gene. Its mechanism implies a toxic gain of function where expanded CUG mRNA repeats increase steady state levels of CUGBP1 protein among other effects. Patients with DM1 develop cataracts. So, it can be hypothesized that CUGBP1 disrupted expression in lenses from DM1 patients can be, at least, one of the causes that leads to cataracts in this disease. In situ hybridization results show that cugbp1 is expressed in the zebrafish lens at early embryonic development in newly formed lens fibers. Transgenic embryos expressing nuclear or membrane localized-EGFP under the control of a 1.2kb cugbp1 promoter further demonstrate its expression in the lens. Knocking down expression of cugbp1 with a splice-altering morpholino results in cataracts as early as 3dpf. Hence, the latter reveals that cugbp1 expression is a requirement for normal lens early development. In morphant embryos, lens fiber compaction is disturbed. In addition, these cells retain nuclei. Lens overall shape and size is also affected. Furthermore, the defective phenotype includes a general developmental delay, little mobility and dilated cardiomyopathy, symptoms that are also observed in DM1 patients. ____________________________________________________________________ El cristalino (lente del ojo) es un tejido transparente en la región anterior del ojo y su rol principal es refractar la luz sobre la retina. El cristalino está constituido por dos tipos de células: células epiteliales y fibras. Las células epiteliales rodean la parte anterior y los límites laterales de la lente del ojo, mantienen su capacidad de proliferación y en el ecuador del cristalino se diferencian para generar fibras. En este proceso, las fibras recién generadas se elongan y gradualmente pierden sus organelas, permitiendo así la transparencia. Las cataratas se refieren a cualquier opacificación del cristalino que comprometa su habilidad de refractar la luz hacia la retina y pueden ser inducidas por la genética o el ambiente. Debido a que se ha demostrado que el pez cebra (Danio rerio) es un organismo ideal para estudiar desordenes oculares humanos, este sistema modelo se utilizó para estudiar productos génicos que regulan el desarrollo normal de la lente y que en estados patológicos contribuyen a la aparición de cataratas. CUGBP1 es una proteína de unión a ARNm que ha sido implicada en la enfermedad multisistémica Distrofia Miotónica 1 (DM1). La DM1 es causada por la expansión de la repetición (CTG)n localizada en la región 3'UTR del gen DMPK. Su mecanismo implica una ganancia de función que es tóxica donde la expansión de las repeticiones CUG del ARNm estabilizan la proteína CUGBP1 provocando un aumento de sus niveles, entre otros efectos. Pacientes con DM1 desarrollan cataratas. Entonces, se puede plantear la hipótesis de que una expresión defectuosa de CUGBP1 en el cristalino de pacientes con DM1 puede ser, por lo menos, una de las causas que conllevan a la formación de cataratas en esta enfermedad. Resultados de ensayos de hibridación in situ muestran que cugbp1 se expresa en la lente del ojo del pez cebra durante el desarrollo embrionario temprano en fibras recién formadas. Embriones transgénicos que expresan la proteína verde fluorescente co-localizada en el núcleo o la membrana celular bajo el control de una región promotora de 1.2kb del gen cugbp1 evidencian aún más su expresión en el cristalino. El disminuir la expresión (knock down) de cugbp1 con un morfolino que altera el proceso de corte y empalme (splicing) resulta en la formación de cataratas a partir de los 3 días después de la fertilización. Por lo tanto, lo anterior revela que la expresión de cugbp1 es un requerimiento para el desarrollo temprano normal de la lente del ojo. En embriones inyectados con el morfolino, la compactación de las fibras del cristalino se ve perturbada. Además, estas células retienen el núcleo. La forma y el tamaño generales de la lente del ojo también se ven afectados. Asimismo, el fenotipo defectuoso incluye un retraso general en el desarrollo, poca movilidad y miocardiopatía dilatada, síntomas que también se observan en pacientes con DM1.The University of Texas at Austin Molecular Cell and Developmental Biology The Gross La

Luciferase reporter for p27Kip1 5'UTR in Celf1 knockdown (Fig 4M)

Data for luciferase reporter assay investigating the up-regulation of 5'UTR fused reporter in Celf1 knockdown lens cell line (Fig. 4M in Siddam et al. 2018 PLOS Genetics

Dnase2b 3' UTR-luciferase mRNA assay (Fig 3H)

RT-qPCR data for quantification of luciferase mRNA fused to Dnase2b 3' UTR in cells with Celf1 over-expression (Fig 3H in Siddam et al. 2018 PLOS Genetics

p27Kip1 mRNA in Celf1 cKO and control mouse lens (Fig 4I)

RT-qPCR data for quantification of p27Kip1 mRNA in control and Celf1 cKO mouse lens (Fig. 4I in Siddam et al. 2018 PLOS Genetics

Quantification of lamin A/C immunofluorescence in Celf1 cKO mouse lens (S11 Fig)

Data for quantification of immunofluorescence signal of lamin A/C in control and Celf1 cKO mouse lens (Supplementary Fig. S11 in Siddam et al. 2018 PLOS Genetics

Quantification of ocular defects in Xenopus celf1-knockdown embryos (S5 Fig)

Data for quantification of ocular phenotypes in celf1-knockdown Xenopus laevis embryos subjected to morpholino-injection on one side (Supplementary Fig. S5 in Siddam et al. 2018 PLOS Genetics

Quantification of p27Kip1 immunofluorescence in mouse lens (Fig 4G)

Immunofluorescence signal was quantified for p27Kip1 staining in the whole lens area (left) and the central fiber cell area (right) of the lens in control and Celf1 cKO lenses. (Fig. 4G in Siddam et al. 2018 PLOS Genetics

iSyTE analysis of Celf1 expression in mouse lens (S1 Fig)

Microarray data values for expression of Celf1 in wild-type mouse lens in three embryonic stages compared to whole embryonic body tissue (Supplementary Fig. S1 in Siddam et al. 2018 PLOS Genetics

RT-qPCR of Dnase2b in mouse lens (Fig 3E)

RT-qPCR assay data for Dnase2b mRNA in WT and Celf1 cKO mouse lens (Fig 3E in Siddam et al. 2018 PLOS Genetics

Celf1 CLIP assay on mouse lens (Fig 3G Fig 4K Fig 5C)

Data for cross-linked immunoprecipitation (CLIP) using Celf1 antibody on wild-type mouse lens followed by RT-qPCR for specific mRNAs: Dnase2b, p27Kip1, Sptb (Fig 3G, Fig 4K, Fig 5C in Siddam et al. 2018 PLOS Genetics