Molecular analysis of the NR0B1 in three Portuguese families with X-linked Adrenal Hypoplasia Congenita

X-linked Adrenal Hypoplasia Congenita (X-linked AHC) is a rare disorder associated with acute adrenal insufficiency in the newborn age that typically cause vomiting, feeding difficulty, dehydration, and shock due to a salt-wasting episode. Hypoglycemia, frequently presenting with seizures, may be the first symptom. If untreated, adrenal insufficiency is lethal. Affected males, despite hormonal treatment, typically have delayed puberty (onset after age 14) caused by hypogonadotropic hypogonadism, and most of them are infertile at adult age. Carrier females may occasionally have symptoms of adrenal insufficiency or hypogonadotropic hypogonadism, possibly caused by skewed X-chromosome inactivation. X-linked AHC is caused by mutations in NR0B1 gene, a critical gene involved in the development of adrenals and hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Since the identification of the NR0B1 gene, numerous mutations have been discovered including deletions, alterations of splice-sites, missense, nonsense and frameshift mutations. Here we present the molecular results obtained in three Portuguese families with NR0B1 mutations. Mutation analysis was performed by PCR followed by SSCP analysis and sequencing of DNA fragments showing abnormal patterns on a second PCR product, or by direct DNA cycle sequencing of PCR products. Molecular analysis of the NR0B1 gene in proband A revealed a nonsense mutation, c.1084A>T, p.Lys362*, in exon 1, not previously described. His mother and sister were asymptomatic carriers; in family B a nonsense mutation, c.243C>G; p.Tyr81*, also in exon 1, was identified in two affected males and their mother and sister were also asymptomatic carriers; in family C a frameshift mutation, c.1292delG, p.Ser431Ilefs*6, in exon 2, was detected in a 7 years old affected male and his mother. The maternal origin of mutations was confirmed in the three families studied. The identification of a NR0B1 mutation in a family has important implications: a correct clinical diagnosis can be established, appropriate clinical management of affected members and suitable genetic counselling can be offered, female carriers can be identified and disease can be prevented

Mutação rara em homozigotia no gene do recetor da hormona libertadora das gonadotrofinas (GNRHR) em doente com hipogonadismo hipogonadotrófico isolado congénito

Trabalho apresentado como poster e depois seleccionado para comunicação oral.INTRODUÇÃO: O hipogonadismo hipogonadotrófico isolado congénito (HHI) caracteriza-se pela falência parcial ou completa do desenvolvimento pubertário na maioria dos casos devido à falta de estímulo das gonadotrofinas induzido pela GnRH. Face à presença ou ausência de olfato o HHI divide-se em dois síndromes: HHI com hiposmia/anosmia ou Síndrome de Kallmann (SK) e HHI com olfacto normal (HHIn). HHIn representa cerca de 40% dos casos de HHI. O HHI pode ser devido a diferentes mutações identificadas em mais de quinze genes. Em cerca de 40%-50% do HHIn familiar e em ~17% dos doentes com a forma esporádica da doença, têm sido identificadas mutações no gene GNRHR. Neste trabalho descreve-se um caso esporádico de HHIn associado a uma mutação rara em homozigotia do gene GNRHR. CASO CLÍNICO: Doente sexo masculino, 37 anos, caucasiano, recorre à consulta para reavaliação hormonal. Refere cirurgia aos 6 anos por criptorquidia bilateral. Nascido de gravidez normal, sem história de consanguinidade dos pais; sem história familiar conhecida de atraso pubertário. Ao longo de anos fez terapêutica hormonal injectável (cuja designação desconhece) de forma irregular, que abandonou aos 27 anos por “não ver resultados”. Obesidade grave desde a adolescência. Peso máximo 150 Kg aos 34 anos. Perda de 56 Kg nos últimos 18 meses (dieta+exercício). Exame físico: ausência de pêlos na face; Alt. 192cm; Enverg. 197cm; Peso 96,3kg; IMC 26; ginecomastia bilateral; testículos atróficos (< 4mL) e micropénis. Sem alterações olfactivas, auditivas ou outras. Avaliação bioquímica: Testosterona total (TT) 71.5 ng/dL (VR 241-827); FSH 0.62 mUI/mL (VR 1.4-18.1); LH <0.07 mUI/mL (VR 1.5-9.3). Doseamentos das restantes hormonas hipofisárias normais; beta-gonadotrofina coriónica normal. A RM hipotálamo-hipofisária não revelou alterações e a densitometria óssea foi compatível com osteopénia do colo do fémur (Tscore:-1.3) e trabecular (Tscore:-1.8). Cariotipo 46,XY. Iniciou testosterona transdérmica 50 mg/dia. TT um mês após início da terapêutica: 737 ng/dL. ESTUDO MOLECULAR: Extração de DNA genómico de sangue periférico, amplificação enzimática dos 3 exões do gene GNRHR e sequenciação cíclica pelo método de Sanger. A análise molecular revelou a presença da alteração c.924_926delCTT (p.Phe309del), em homozigotia, no exão 3 do gene GNRHR. O estudo complementar dos progenitores revelou, em ambos, a presença em heterozigotia da referida mutação. DISCUSSÃO: Evidencia-se que no presente doente a alteração c.924_926delCTT foi detectada em homozigotia tendo-se comprovado o genótipo do mesmo através do estudo dos seus progenitores. Esta alteração já foi descrita em heterozigotia composta (associada a outra mutação diferente no mesmo gene) em dois doentes com HHI (não familiares)1,2 e em heterozigotia em dois familiares (pai e filha, ambos com atraso pubertário)2, sendo esta a primeira vez que é descrita em homozigotia. Trata-se de uma alteração extremamente rara em que o estudo molecular permite inferir que houve falência na ativação do eixo gonadotrófico desde a vida intrauterina. O defeito molecular identificado, poderá ter condicionado a integração/posicionamento do GNRHR na membrana celular, o que terá bloqueado o estímulo da GnRH que induz à síntese de FSH e de LH, permitindo explicar o HHI congénito do doente em causa

Importância do estudo multigénico no diagnóstico molecular de doenças raras por sequenciação de nova geração

Introdução: A sequenciação de nova geração (NGS) revolucionou o diagnóstico molecular das doenças raras (DR) proporcionando a análise de um maior número de genes, resultados mais rápidos e custos reduzidos. A NGS usando diferentes abordagens, possibilita o estudo do genoma (WGS), do exoma (WES), de genes individuais ou de painéis multigénicos (NGS-PMG). Objetivos: Aplicação de NGS-PMG no estudo de doenças raras específicas. Métodos: Preparação de bibliotecas de sequências-alvo a partir de DNA genómico, utilizando a captura com sondas (Trusight Cancer-Rapid Capture, Illumina) ou amplicões (painéis customizados - AmpliSeq, Illumina). Sequenciação no MiSeq (Illumina) e análise bioinformática usando software da Illumina e programas disponíveis on line. Validação de alterações pontuais por sequenciação de Sanger. Resultados: A utilização da metodologia Trusight-Cancer, que inclui a sequenciação de 94 genes de suscetibilidade para cancro hereditário (CH), permite-nos a análise seletiva de PMG, aplicados ao estudo de por ex., síndrome de Lynch, Polipose Adenomatose Familiar, cancro Hereditário da Mama e Ovário). A aplicação de PMG por AmpliSeq a um painel de genes desenhado in silico e específico de patologias do desenvolvimento sexual (PDS), permite-nos a análise molecular de 40 genes associados a hipogonadismo, Síndrome de Kallmann, insensibilidade aos androgénios, androgenização precoce, ciliopatias, falância ovárica prematura. Os resultados obtidos (sem falsos negativos), permitiram detetar diferentes tipos de alterações moleculares em doentes com diferentes DR, proporcionando em muitos um diagnóstico definitivo. Destaca-se que a estratégia de NGS implementada para o CH, integra também a avaliação de variações do número de cópias (deleções e duplicações) e a validação destes resultados por metodologia diferente - MLPA. Conclusões: A utilização de NGS-PMG possibilitando a identificação de novas variantes em novos genes, permite confirmar o diagnóstico clínico e contribuir para um melhor acompanhamento dos doentes e prevenção da doença genética hereditária. No caso de doenças cujo fenótipo não permite inferir um PMG a analisar, o alargamento ao WES ou ao WGS, para além de poder contribuir para o diagnóstico, gerará novo conhecimento e eventualmente o desenvolvimento de terapias inovadores.Trabalho parcialmente financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Projeto: UID/BIM/0009/2016info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Validação e implementação do diagnóstico molecular em cancro coloretal hereditário (ccrh) por sequenciação de nova geração

A análise molecular tradicional na síndrome de Lynch, associada a alterações nos genes MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 e EPCAM, na polipose adenomatosa familiar (FAP), causada por alterações no gene APC e na polipose associada a alterações no gene MUTYH, é baseada na PCR e na sequenciação pelo método de Sanger, tem custos elevados e é demorada, pelo que é relevante a sua substituição pela sequenciação de nova geração (NGS) permitindo esta, a análise simultânea de múltiplos genes, com custos mais reduzidos e num menor intervalo de tempo. Tendo por objetivo disponibilizar a análise molecular por NGS para CCRH, procedeu-se à sua validação para os genes MLH1, MSH2, APC, MUTYH, STK11, em 26 amostras, previamente analisados pelo método de Sanger. Utilizou-se a tecnologia da Illumina que compreende o Trusight Cancer Sequencing Panel (que possibilita a análise de 94 genes), o kit TruSight Rapid Capture, o sequenciador MiSeq e a respetiva análise bioinformática com os softwares apropriados. Foram detetadas por NGS 78 alterações nos genes anteriormente referidos, 32 alterações correspondem a variantes únicas [5 deleções de tamanho variável (2 a 17 nucleótidos), uma inserção-deleção e 26 alterações envolvendo um único nucleótido], tendo todas as alterações sido previamente identificadas pelo método de Sanger. Os resultados obtidos demonstram a elevada sensibilidade e especificidade da NGS na deteção de alterações nos genes em causa permitindo, assim, disponibilizar a NGS para um painel alargado de genes de suscetibilidade para CCRH, permitindo um diagnóstico molecular mais abrangente, rápido e mais económico relativamente à sequenciação de Sanger

Validation of next-generation sequencing for the diagnosis of hereditary breast and ovarian cancer

Introduction: Molecular diagnosis of hereditary breast and ovarian cancer (HBOC) has been mostly based on the identification of germline inactivating mutations in the high-penetrant genes BRCA1 and BRCA2. Although several other HBOC susceptibility genes have been identified, mutations in any of those are rare, rendering sequential genetic testing with standard methodologies time consuming and expensive. Next-generation sequencing (NGS) gene panels allow the simultaneous sequencing of multiple HBOC susceptibility genes at a lower cost. The aim of this work was to validate the use of an NGS cancer susceptibility gene panel for the identification of mutations previously detected by Sanger sequencing in the BRCA1, BRCA2 and TP53 genes. Methods: 20 samples from patients with personal/family history of breast cancer were sequenced on a MiSeq using the Trusight Cancer Sequencing Panel (Illumina). Bioinformatic analysis of NGS data included the MiSeq Reporter, VariantStudio and Isaac Enrichment tools (Illumina). Results: NGS successfully identified all 204 variants (38 unique, including 2 deletions and a splice variant) previously detected by Sanger sequencing in the BRCA1, BRCA2 and TP53 genes. Until now, no false-negative or false-positive results were obtained. Discussion: These results demonstrate the high analytical sensitivity and specificity obtained with NGS for the detection of sequence variants in 3 HBOC high-penetrant genes. These validation assays open the way to the definition of a clinically useful multigene panel for HBOC susceptibility based on the Trusight Cancer Sequencing Panel. This will allow a comprehensive and cost-effective molecular diagnosis of HBOC with a shorter turnaround time when compared to standard methodologies. In addition, with appropriate genetic counselling and specialized clinical surveillance, families with HBOC will benefit from these new technologies which have high impact in public health

Inherited Colorectal Cancer - validation of molecular diagnosis by Next Generation Sequencing

Introduction:Colorectal cancer is the third major cause of cancer related deaths worldwide. Around 5% of these cases are due to Inherited Colorectal Cancer (ICC) associated with highly penetrant single-gene mutations. Conventional molecular analysis of patients with ICC is well established and usually comprises PCR followed by Sanger sequencing of different genes with autosomal dominant inheritance - MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 and EPCAM-3’ deletions in Lynch syndrome, APC in Familial Adenomatous Polyposis (FAP), or the study of an autosomal recessive condition with colorectal polyps associated with MUTYH variants. As standard molecular methodologies have high costs and are time consuming, they are progressively being replaced by Next Generation Sequencing (NGS), which allows the analysis of multiple genes simultaneously and with lower costs compared to Sanger sequencing. In order to validate NGS analysis for a set of genes associated with ICC, we performed NGS in 26 DNA samples from patients previously analysed by Sanger sequencing. Methods: NGS was performed using the Trusight Cancer Sequencing Panel and the MiSeq sequencer (Illumina), followed by bioinformatic analysis of the MLH1, MSH2, APC, MUTYH and STK11 genes using the MiSeq Reporter, VariantStudio and Isaac Enrichment tools. Results: Data analysis revealed 77 variants (31 unique, comprising 4 deletions, 1 insertion, 2 indels and 24 single nucleotide variants). Of these, 76 variants were previously identified by Sanger sequencing. NGS produced a false positive result associated with low coverage in STK11 (c.375-49G>A). Discussion: Results obtained by NGS are consistent with Sanger sequencing and showed high analytical sensitivity and specificity. Therefore after this initial validation, with high repeatability, conventional molecular analysis can be replaced by NGS, allowing us to offer the possibility to screen more genes, at lower costs and with a shorter turnaround time

Validação da sequenciação de nova geração (NGS) no diagnóstico molecular de formas hereditárias de cancro da mama e colorretal

Introdução: O cancro da mama e o cancro colorretal constituem, entre as patologias oncológicas, duas das principais causas de morte. Cinco a 10% destes casos estão associados a alterações germinais em genes reconhecidamente associados a suscetibilidade para desenvolvimento de formas hereditárias de cancro da mama e de cancro colorretal. Objetivos: O presente trabalho teve como objetivo validar a metodologia de sequenciação de nova geração (NGS), por comparação com os resultados obtidos previamente pelo método de Sanger, para diversas variantes presentes em diferentes genes - BRCA1, BRCA2, TP53, APC, MUTYH, MLH1, MSH2 e STK11 - que conferem suscetibilidade para desenvolvimento de cancro da mama e/ou colorretal. Métodos: Foram sequenciadas por NGS 64 amostras de DNA de utentes com suspeita clínica de predisposição hereditária para cancro da mama ou colorretal, utilizando o painel de sequenciação TruSight Cancer (análise de 94 genes) e a plataforma MiSeq (Illumina). A análise bioinformática dos resultados foi realizada com recurso aos softwares MiSeq Reporter, VariantStudio e Isaac Enrichment (Illumina).N/

Aplicação da sequenciação de nova geração ao diagnóstico genético do cancro da mama hereditário

Introdução: O cancro da mama hereditário (CMH) constitui 5-10% dos casos de cancro da mama, dos quais cerca de 30% se devem a mutações germinais de elevada penetrância nos genes BRCA1 e BRCA2. Embora tenham sido identificadas mutações noutros genes de suscetibilidade para cancro da mama, estas são raras, pelo que a análise sequencial de múltiplos genes se torna ineficaz e dispendiosa pelos métodos convencionais(1,2). A determinação da causa genética subjacente ao CMH permite não só identificar os indivíduos com risco aumentado de cancro da mama, como oferecer uma medicina personalizada, mais eficaz na redução da incidência de cancro da mama assim como da morbilidade e mortalidade associadas(3). A sequenciação de nova geração (NGS) veio possibilitar a pesquisa de mutações em múltiplos genes em simultâneo, permitindo um diagnóstico molecular rápido, eficaz e com custo inferior ao da sequenciação de Sanger. Objetivos: Otimizar o diagnóstico molecular do CMH através da implementação de um protocolo de NGS baseado num painel abrangente de genes de suscetibilidade para cancro da mama. A 1ª fase de concretização deste objetivo consistiu em validar a utilização da NGS na deteção de mutações nos genes BRCA1, BRCA2 e TP53. Material e métodos: Foram analisadas por NGS 12 amostras de doentes com cancro da mama, previamente sequenciadas pelo método de Sanger para os genes BRCA1, BRCA2 e TP53. As bibliotecas de sequências-alvo foram preparadas a partir de DNA genómico pelo método de captura por hibridação, num protocolo que integrou o Trusight Cancer Sequencing Panel e o kit TruSight Rapid Capture (Illumina), e sequenciadas numa plataforma MiSeq com leituras paired-end de 150 bp. A análise bioinformática incluiu os softwares MiSeq Reporter, VariantStudio e Isaac Enrichment (Illumina). Resultados: Foram detetadas por NGS um total de 97 variantes de sequência nos genes BRCA1, BRCA2 e TP53, das quais 35 são variantes únicas (33 single nucleotide variants e 2 deleções), numa concordância de 100% com a sequenciação de Sanger. Conclusões: Estes resultados preliminares comprovam a eficiência da NGS na deteção de variantes em 3 genes de elevada penetrância para cancro da mama e abrem caminho para a oferta de um painel de genes de suscetibilidade para cancro da mama que permitirá um diagnóstico molecular do CMH mais abrangente, rápido e com custos reduzidos relativamente à sequenciação de Sanger. Bibiografia 1. Tung N, Batteli C, Allen B et al. (2015). Frequency of mutations in individuals with breast cancer referred for BRCA1 and BRCA2 testing using next-generation sequencing with a 25-gene panel. Cancer, 121: 25-33. 2. Apostolou P, Fostira F (2013). Hereditary breast cancer: the era of new susceptibility genes. BioMed Res Int, 2013: 747318. 3. Ellsworth R, Decewicz D, Shriver C, Ellsworth D (2010). Breast cancer in the personal genomics era. Curr Genomics, 11: 146-161

Hiperplasia congénita da supra-renal não clássica (hcsr-nc) por deficiência de 21-hidroxilase: avaliação clínica e aconselhamento genético de duas famílias portuguesas

Introdução: A hiperplasia congénita da supra renal surge por deficiência de 21-hidroxilase em 90-95% dos casos. É uma das doenças hereditárias de transmissão autossómica recessiva mais frequente. A gravidade da doença resulta do grau de deficiência enzimática da 21-hidroxilase, que depende da mutação que ocorre no gene CYP21A2. Pode ter duas apresentações clínicas: a forma clássica (perdedora de sal ou simplesmente virilizante) mais grave e a forma não clássica (ou expressão tardia) com bloqueio enzimático menos grave. Objetivos: Estudo de duas famílias portuguesas com HCSR-NC para melhor avaliação clínica e aconselhamento genético dessas famílias.N/

Pesquisa de microdeleções AZF em homens inférteis na população portuguesa

A infertilidade conjugal, definida como a incapacidade de conceção de um casal ao fim de um ano de relações sexuais desprotegidas, afeta 10 a 15% dos casais em idade reprodutiva, sendo que as causas masculinas constituem 30 a 40% das causas de infertilidade dos casais. Etiologicamente, a infertilidade masculina pode ter origem genética e não genética. De entre as causas genéticas mais frequentes destacam-se as alterações numéricas ou estruturais dos cromossomas, as mutações no gene CFTR e as microdeleções do cromossoma Y. No braço longo do cromossoma Y, em Yq11.2, localizam-se três regiões AZF (Azoospermia factor), AZFa, AZFb e AZFc, fundamentais para a fertilidade masculina uma vez que possuem múltiplos genes com expressão testicular implicados nas diferentes etapas da espermatogénese (1,2). As microdeleções do Y podem abranger uma ou mais destas regiões, e dependendo da região AZF delecionada ou ausente, a fertilidade pode ser mais ou menos afetada, observando-se diferentes padrões histológicos testiculares, que vão desde o síndrome de só-células-de-sertoli (deleção de AZFa), a paragem de maturação dos gâmetas durante a meiose (deleção AZFb) e a hipoespermatogénese (deleção de AZFc). Estas microdeleções representam a segunda causa genética mais frequente de falha espermatogénica em homens inférteis a seguir ao síndrome de klinefelter (cariotipo 47,XXY). O diagnóstico molecular das microdeleções AZF no cromossoma Y é um teste genético recomendado por rotina em homens inférteis que apresentem oligozoospermia grave (<5x106 espermatozoides/ml de sémen ejaculado) ou azoospermia secretora de causa desconhecida