Untersuchung von endosomalem Recycling von synaptischen Vesikeln

Während der Kommunikation in chemischen Synapsen verschmelzen kleine mit Neurotransmitter gefüllte synaptische Vesikel, die sich in der prä-synaptischen Nervenendigung (Bouton) befinden, mit der Zellmembran (Exozytose) and entlassen ihren Neurotransmitter in den synaptischen Spalt. Die Vesikel werden zurück in das Bouton gestülpt (Endozytose), wo sie mit neu befüllt werden und für weitere Exozytose-Runden in den Vesikel Pool integriert werden (Vesikel Recycling). Wie synaptische Vesikel wiederverwertet werden wird bereits seit mehr als drei Jahrzehnten diskutiert. Hier haben wir die Beteiligung von Endosomen beim Recycling von synaptischen Vesikeln anhand einer Vielzahl an Bildgebungsverfahren untersucht. Erstens haben wir drei neue Exozytose-Reporter generiert, indem wir eine pH-abhängige GFP Variante (pHluorin) mit der lumenalen Domäne der endosomalen Proteine Vti1a, Syntaxin 13 und Syntaxin 6 gekoppelt haben. Wir haben diese Reporter in Hippocampus Neuronen exprimiert und ihre Zirkulation während verschiedener Stimulationen verglichen. Dabei haben wir gefunden, dass sie vorzugsweise durch eine readily releasable pool Stimulation (RRP; 20Hz / 2 Sekunden) mobilisiert werden. Zweitens, indem wir Photo-oxidations Elektronen Mikroskopie von FM Farbstoff-gefärbten RRP Vesikeln verwendet haben, haben wir das vorübergehende Aufkommen großer gefärbter Organellen 10 Sekunden nach der Stimulation beobachtet, was auf die Verschmelzung von endozytierten Vesikeln mit Endosomen hindeutete. Als nächstes haben wir hochauflösende Dünnschnitt STED Mikroskopie und Video-geschwindigkeits Live-STED Mikroskopie angewendet um zu bestätigen, dass RRP Vesikel mit Endosomen (gekennzeichnet durch Rab5-GFP) verschmelzen. Interessanterweise schien stärkere recycling pool Stimulation (20 Hz / 30 Sekunden) keine bessere Kolokalisation von Vesikeln und Endosomen hervorzurufen. Drittens haben wir zytosolische Syntaxin 13 Fragmente exprimiert um die Bildung von endosomalen Fusionskomplexen, und somit die Verschmelzung von Vesikeln und Endosomen, zu blockieren. Auffallenderweise zog diese Störung eine drastische ~60% Reduktion der RRP Größe nach sich, was die Wichtigkeit endosomaler Funktion für den RRP hervorhebt. Viertens zeigten 2-Farben STED Messungen, dass synaptische Vesikel in der Zellmembran als mehr-Komponenten Verbünde bestehen, während der Vergleich von allgemeinem Pool und kürzlich endozytiertem Pool isolierter Vesikel aufdeckte, dass Endozytose unreine Vesikel zurückgewinnt und so endosomales Aufreinigen bedingt. Dies ist eine der ersten Untersuchungen, die einen molekularen und mechanistischen Bestimmungsfaktor von RRP Vesikeln vorschlägt. Wir schlussfolgern, dass die RRP Vesikel in einem hochgradig Verschmelzungs-kompetenten Zustand erhalten werden da sie durch Endosomen geschleust werden, so dass sie die privilegierten Vesikel sind, die während physiologischer Aktivität benutzt werden

SNARE Function Is Not Involved in Early Endosome Docking

Docking and fusion of transport vesicles constitute elementary steps in intracellular membrane traffic. While docking is thought to be initiated by Rab-effector complexes, fusion is mediated by SNARE (N-ethylmaleimide-sensitive factor [NSF] attachment receptor) proteins. However, it has been recently debated whether SNAREs also play a role in the establishment or maintenance of a stably docked state. To address this question, we have investigated the SNARE dependence of docking and fusion of early endosomes, one of the central sorting compartments in the endocytic pathway. A new, fluorescence-based in vitro assay was developed, which allowed us to investigate fusion and docking in parallel. Similar to homotypic fusion, docking of early endosomes is dependent on the presence of ATP and requires physiological temperatures. Unlike fusion, docking is insensitive to the perturbation of SNARE function by means of soluble SNARE motifs, SNARE-specific Fab fragments, or by a block of NSF activity. In contrast, as expected, docking is strongly reduced by interfering with the synthesis of phosphatidyl inositol (PI)-3 phosphate, with the function of Rab-GTPases, as well as with early endosomal autoantigen 1 (EEA1), an essential tethering factor. We conclude that docking of early endosomes is independent of SNARE function