Enhancing Cryptosporidium parvum recovery rates for improved water monitoring

AbstractWater monitoring is essential to ensure safe drinking water for consumers. However existing methods have several drawbacks, particularly with regard to the poor recovery of Cryptosporidium due to the inability to efficiently elute Cryptosporidium oocysts during the established detection process used by water utilities. Thus the development of new inexpensive materials that could be incorporated into the concentration and release stage that would control Cryptosporidium oocysts adhesion would be beneficial. Here we describe improved filter performance following dip-coating of the filters with a “bioactive” polyacrylate. Specifically 69% more oocysts were eluted from the filter which had been coated with a polymer than on the naked filter alone

Photochemical modification if thin polymeric films for applications in nano-biotechnology

In the context of this PhD thesis, routes for the application of photolithographic polymeric materials films in patterning of small biomolecules, proteins and cells were investigated and methods for achieving this goal were developed. Polymeric films were chosen since they are more resilient than self-assembled monolayers and they can be patterned in a straightforward manner by modifying standard lithographic techniques. The proposed approaches offer the advantages of photolithography based methods i.e. accuracy, reliability, adaptability to different substrates and easy integration in the fabrication of Microarrays, Bio-Microelectromechanical systems, and generally in mass fabrication processes.In the first part of the Thesis the development of a procedure for the patterning of biomolecules through chemical bonding on patterned films of an epoxy-based resist was achieved. The innovative aspect in this approach relies in the fact that the modification of the surface for the chemical binding of the biomolecule and the photolithography are performed by the same material leading to a single step not-time consuming procedure. In addition, the high resolution patterning capability of the used photoacid generator containing epoxy resist is employed. Using deep UV exposure and contact printing, upon optimization of lithographic process conditions, arrays of sulfosuccinimidyl-6-biotin-amido hexanoate spots with diameter down to 0.5 μm were created on which streptavidin was successfully immobilized.In the second part of the PhD thesis a photolithographically patternable material that resists the protein adsorption and the adherence of cells was applied for biopatterning. The process is based on the patterning of poly(vinyl alcohol) (PVA) films by photochemically induced crosslinking. This photolithographic approach reported in the past for DUV Lithography was modified in order to be appropriate for bio-applications. For achieving selective protein patterning through the PVA photolithographic process polystyrene (PS) was selected as the most suitable underlayer for protein adsorption. Following the proposed photolithographic procedure structures down to 2.5 μm were created. The patterned surfaces were immersed into protein solutions and it was observed that proteins were immobilized only to the PS regions while they were not adsorbed on the PVA structures. Next, the selective adherence of cells on suitable substrates was also demonstrated by applying the photolithographic patterning of PVA.Κατά τη διάρκεια της Διδακτορικής Διατριβής διερευνήθηκαν δυνατότητες χρησιμοποίησης υμενίων φωτολιθογραφικών υλικών για τη σχηματοποίηση μικρών βιομορίων, πρωτεϊνών και κυττάρων και αναπτύχθηκαν μέθοδοι για την επίτευξη αυτού του σκοπού. Επιλέχθηκε η χρησιμοποίηση πολυμερικών υμενίων, επειδή αυτά είναι πιο ανθεκτικά σε σχέση με τα Αυτοοργανωμένα Μονομοριακά Στρώματα και είναι εύκολο να σχηματοποιηθούν με τροποποίηση καθιερωμένων τεχνικών φωτολιθογραφίας. Οι προτεινόμενες προσεγγίσεις έχουν τα πλεονεκτήματα των μεθόδων που στηρίζονται στη φωτολιθογραφία δηλαδή υψηλή ακρίβεια, επαναληψιμότητα, δυνατότητα χρήσης σε διάφορα υποστρώματα και εύκολη ενσωμάτωση σε διεργασίες κατασκευής Μικροσυστοιχιών και Βιο-Μικροηλεκτρομηχανικών Συστημάτων και γενικότερα σε διεργασίες μαζικής παραγωγής.Στο πρώτο μέρος της Διδακτορικής Διατριβής επιτεύχθηκε η ανάπτυξη διεργασίας για τη σχηματοποίηση βιομορίων με χημική πρόσδεση σε σχηματοποιημένο λιθογραφικό υμένιο εποξειδικής ρητίνης. Η καινοτομία αυτής της προσέγγισης έγκειται στο γεγονός ότι η τροποποίηση της επιφάνειας για την ομοιοπολική πρόσδεση των βιομορίων και η φωτολιθογραφία επιτελούνται από το ίδιο υλικό οδηγώντας σε μία μη χρονοβόρα διεργασία ενός σταδίου. Παράλληλα, αξιοποιείται η δυνατότητα λιθογραφίας υψηλής διακριτικής ικανότητας που παρέχει το φωτολιθογραφικό υλικό που επιλέχθηκε, το οποίο ήταν εποξειδική ρητίνη που περιείχε φωτοπαραγωγό οξέος. Χρησιμοποιώντας έκθεση στο βαθύ υπεριώδες και εκτύπωση επαφής με βελτιστοποίηση της λιθογραφικής διεργασίας κατασκευάστηκαν συστοιχίες του θειϊκού Ν-υδροξυηλεκτριμιδοεστέρα της βιοτίνης μέχρι 0.5 μm στις οποίες ακινητοποιήθηκε επιτυχώς στρεπταβιδίνη.Στο δεύτερο μέρος της Διδακτορικής Διατριβής ένα φωτολιθογραφικά σχηματοποιήσιμο υλικό, το οποίο ανθίσταται στην προσρόφηση πρωτεϊνών και στην προσκόλληση κυττάρων, αξιοποιήθηκε για την επιλεκτική ακινητοποίησή τους. Η διεργασία αυτή βασίζεται στη σχηματοποίηση υμενίων πολυ(βινυλικής αλκοόλης) μέσω φωτοχημικά προκαλούμενης διασταύρωσης. Ακολουθώντας την προτεινόμενη φωτολιθογραφική διεργασία κατασκευάστηκαν δομές μέχρι 2.5 μm πάνω από υμένιο πολυστυρενίου. Οι σχηματοποιημένες επιφάνειες εμβαπτίστηκαν σε διαλύματα πρωτεϊνών και παρατηρήθηκε ότι οι πρωτεΐνες ακινητοποιούνται μόνο στις περιοχές του πολυστυρενίου, ενώ δεν προσροφώνται στις δομές της πολυ(βινυλικής αλκοόλης). Στη συνέχεια εφαρμόζοντας τη σχηματοποίηση της πολυ(βινυλικής αλκοόλης) επιτεύχθηκε η επιλεκτική προσκόλληση κυττάρων σε κατάλληλα υποστρώματα

Photochemical modification of thin polymeric films for applications in Nano-biotechnology

248 σ.Κατά τη διάρκεια της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής διερευνήθηκαν δυνατότητες χρησιμοποίησης υμενίων φωτολιθογραφικών υλικών για τη σχηματοποίηση μικρών βιομορίων, πρωτεϊνών και κυττάρων και αναπτύχθηκαν μέθοδοι για την επίτευξη αυτού του σκοπού. Επιλέχθηκε η χρησιμοποίηση πολυμερικών υμενίων, επειδή αυτά είναι πιο ανθεκτικά σε σχέση με τα Αυτοοργανωμένα Μονομοριακά Στρώματα και είναι εύκολο να σχηματοποιηθούν με τροποποίηση καθιερωμένων τεχνικών φωτολιθογραφίας. Οι προτεινόμενες προσεγγίσεις έχουν τα πλεονεκτήματα των μεθόδων που στηρίζονται στη φωτολιθογραφία δηλαδή υψηλή ακρίβεια, επαναληψιμότητα, δυνατότητα χρήσης σε διάφορα υποστρώματα και εύκολη ενσωμάτωση σε διεργασίες κατασκευής Μικροσυστοιχιών και Βιο-Μικροηλεκτρομηχανικών Συστημάτων και γενικότερα σε διεργασίες μαζικής παραγωγής. Στο πρώτο μέρος της Διδακτορικής Διατριβής επιτεύχθηκε η ανάπτυξη διεργασίας για τη σχηματοποίηση βιομορίων με χημική πρόσδεση σε σχηματοποιημένο λιθογραφικό υμένιο εποξειδικής ρητίνης. Η καινοτομία αυτής της προσέγγισης έγκειται στο γεγονός ότι η τροποποίηση της επιφάνειας για την ομοιοπολική πρόσδεση των βιομορίων και η φωτολιθογραφία επιτελούνται από το ίδιο υλικό οδηγώντας σε μία μη χρονοβόρα διεργασία ενός σταδίου. Παράλληλα, αξιοποιείται η δυνατότητα λιθογραφίας υψηλής διακριτικής ικανότητας που παρέχει το φωτολιθογραφικό υλικό που επιλέχθηκε, το οποίο ήταν εποξειδική ρητίνη που περιείχε φωτοπαραγωγό οξέος. Ο θειϊκός Ν-υδροξυηλεκτριμιδοεστέρας της βιοτίνης βρέθηκε ότι αντιδρά εύκολα με τους εποξειδικούς δακτυλίους στις σχηματοποιημένες δομές, ενώ η πρόσδεση της βιοτίνης στη σχηματοποιημένη εποξειδική ρητίνη ήταν αμελητέα, αποκλείοντας την πιθανότητα φυσικής προσρόφησης του θειϊκού Ν-υδροξυηλεκτριμιδοεστέρα της βιοτίνης. Χρησιμοποιώντας έκθεση στο βαθύ υπεριώδες και εκτύπωση επαφής με βελτιστοποίηση της λιθογραφικής διεργασίας κατασκευάστηκαν συστοιχίες του θειϊκού Ν-υδροξυηλεκτριμιδοεστέρα της βιοτίνης μέχρι 0.5 μm στις οποίες ακινητοποιήθηκε επιτυχώς στρεπταβιδίνη. Στο δεύτερο μέρος της Διδακτορικής Διατριβής ένα φωτολιθογραφικά σχηματοποιήσιμο υλικό, το οποίο ανθίσταται στην προσρόφηση πρωτεϊνών και στην προσκόλληση κυττάρων, αξιοποιήθηκε για την επιλεκτική ακινητοποίησή τους. Η διεργασία αυτή βασίζεται στη σχηματοποίηση υμενίων πολυ(βινυλικής αλκοόλης) (poly(vinyl alcohol), PVA) μέσω φωτοχημικά προκαλούμενης διασταύρωσης. Η φωτολιθογραφική διεργασία η οποία έχει εφαρμοστεί στο παρελθόν για λιθογραφία στο βαθύ υπεριώδες τροποποιήθηκε έτσι ώστε να καταστεί κατάλληλη για βιο-εφαρμογές. Η διασταυρωμένη PVA ανθίσταται στην προσρόφηση των πρωτεϊνών ακόμα και μετά από επώαση 22 ωρών σε διάλυμα πρωτεϊνών. Για την επίτευξη της επιλεκτικής σχηματοποίησης πρωτεϊνών μέσω της φωτολιθογραφικής διεργασίας της PVA επιλέχθηκε το πολυστυρένιο ως πιο κατάλληλο πολυμερικό υπόστρωμα. Ακολουθώντας την προτεινόμενη φωτολιθογραφική διεργασία κατασκευάστηκαν δομές μέχρι 2.5 μm. Οι σχηματοποιημένες επιφάνειες εμβαπτίστηκαν σε διαλύματα πρωτεϊνών και παρατηρήθηκε ότι οι πρωτεΐνες ακινητοποιούνται μόνο στις περιοχές του πολυστυρενίου, ενώ δεν προσροφώνται στις δομές της PVA. Στη συνέχεια εφαρμόζοντας τη σχηματοποίηση της PVA επιτεύχθηκε η επιλεκτική προσκόλληση κυττάρων σε κατάλληλα υποστρώματα. Βρέθηκε ότι τα κύτταρα προσκολλώνται επιλεκτικά στις περιοχές που έχουν αποκαλυφθεί μετά τη φωτολιθογραφία της PVA, ενώ δεν προσκολλώνται στις δομές της PVA.In the context of this PhD thesis, routes for the application of photolithographic polymeric materials films in patterning of small biomolecules, proteins and cells were investigated and methods for achieving this goal were developed. Polymeric films were chosen since they are more resilient than self-assembled monolayers and they can be patterned in a straight forward manner by modifying standard lithographic techniques. The proposed approaches offer the advantages of photolithography based methods i.e. accuracy, reliability, adaptability to different substrates and easy integration in the fabrication of Microarrays, Bio-ΜicroΕlectroΜechanical systems (BioMEMs), and generally in mass fabrication processes. In the first part of the Thesis the development of a procedure for the patterning of biomolecules through chemical bonding on patterned films of an epoxy-based resist was achieved. The innovative aspect in this approach relies in the fact that the modification of the surface for the chemical binding of the biomolecule and the photolithography are performed by the same material leading to a single step not-time consuming procedure. In addition, the high resolution patterning capability of the used photoacid generator containing epoxy resist is employed. The sulfosuccinimidyl-6-biotin-amido hexanoate was found to react readily with the epoxy rings onto the patterned structures, while the binding of non-modified biotin is negligible οn the patterned structures excluding the possibility of having physical adsorption of the biotin. Using deep UV exposure and contact printing, upon optimization of lithographic process conditions, arrays of sulfosuccinimidyl-6-biotin-amido hexanoate spots with diameter down to 0.5 μm were created on which streptavidin was successfully immobilized. In the second part of the PhD thesis a photolithographically patternable material that resists the protein adsorption and the adherence of cells was applied for biopatterning. The process is based on the patterning of poly(vinyl alcohol) (PVA) films by photochemically induced crosslinking. This photolithographic approach applied in the past for DUV Lithography was modified in order to be appropriate for bio-applications. The crosslinked PVA resists remarkably the adsorption of proteins even after 22 h incubation to protein solution. For achieving selective protein patterning through the PVA photolithographic process polystyrene (PS) was selected as the most suitable underlayer for protein adsorption. Following the proposed photolithographic procedure structures down to 2.5 μm were created. The patterned surfaces were immersed into protein solutions and it was observed that proteins were immobilized only to the PS regions while they were not adsorbed on the PVA structures. Next, the selective adherence of cells on suitable substrates was also demonstrated by applying the photolithographic patterning of PVA. It was shown that cells adhere selectively on the regions that were revealed after the removal of the unexposed PVA film, while cells do not adhere on the PVA structures.Παγώνα Π. Παυλ

Protein-Resistant Cross-Linked Poly(vinyl alcohol) Micropatterns via Photolithography Using Removable Polyoxometalate Photocatalyst

In the last years, there has been an increasing interest in controlling the protein adsorption properties of surfaces because this control is crucial for the design of biomaterials. On the other hand, controlled immobilization of proteins is also important for their application as solid surfaces in immunodiagnostics and biosensors. Herein we report a new protein patterning method where regions of the substrate are covered by a hydrophilic film that minimizes protein adsorption. Particularly, poly­(vinyl alcohol) (PVA) cross-linked structures created by an especially developed photolithographic process are proved to prevent protein physisorption and they are used as a guide for selective protein adsorption on the uncovered areas of a protein adsorbing substrate such as polystyrene. The PVA cross-linking is induced by photo-oxidation using, as a catalyst, polyoxometalate (H₃PW₁₂O₄₀ or α-(NH₄)₆P₂W₁₈O₆₂), which is removed using a methyl alcohol/water mixed solvent as the developer. We demonstrate that the polystyrene and the cross-linked PVA exhibit dramatically different performances in terms of protein physisorption. In particular, the polystyrene areas presented up to 130 times higher protein binding capacity than the PVA ones, whereas the patterning resolution could easily reach dimensions of a few micrometers. The proposed approach can be applied on any substrate where PVA films can be coated for controlling protein adsorption onto surface areas custom defined by the user