Análise da regulação transcricional de genes de Yersinia em Escherichia coli

Bactérias do gênero Yersinia possuem um sistema de secreção tipo III, responsável pela translocação de fatores protéicos conhecidos como Yops, para o interior de células eucarióticas do hospedeiro. A proteína YopH é uma tirosina fosfatase que atua desfosforilando moléculas sinalizadoras e impedindo a fagocitose em macrófagos. Para uma secreção eficiente, ela necessita da presença da chaperona SycH que permite o seu reconhecimento pela maquinaria de secreção. Com a finalidade de analisar a expressão da proteína YopH em E. coli, foi construído um promotor híbrido formado pelo promotor lac de Escherichia coli seguido do promotor yopH de Yersinia enterocolitica. Este promotor foi capaz de direcionar uma forte expressão da YopH, em E. coli, e uma síntese ótima de YopH foi observada com o aumento da temperatura (37oC) e em culturas em fase de crescimento. A expressão da YopH foi investigada em linhagens defectivas de E. coli para as proteínas homólogas às histonas, Hha e H-NS. A expressão foi significantemente maior a 24oC que a 37oC, na ausência de H-NS, mas não na ausência de Hha. Estes resultados são compatíveis com o papel da H-NS na regulação da atividade do promotor yoph, possivelmente através da presença de curvas em sua estrutura. Para determinar se a presença da chaperona SycH influenciaria na expressão da YopH, em E. coli, a sequência codificadora para esta proteína foi amplificada e clonada no plasmídio pBAD33. Foi observada a expressão da SycH em culturas de E. coli, apenas na presença de arabinose. A co-expressão das proteínas YopH e SycH, em EPEC, revelou uma redução na expressão da YopH, na presença de arabinose. O mesmo foi observado em culturas de EPEC contendo apenas o plasmídio pTZ/YopH, onde concentrações variadas de arabinose e glicose estariam influenciando a expressão da YopH. Para verificar o potencial da proteína YopH no diagnóstico da peste, diversos soros de pacientes suspeitos de peste e coelhos imunizados com Y. pestis foram testados por Western-blot. Não houve reconhecimento da YopH nos soros testado

Contribuição para o diagnóstico de peste

Apesar de sua fundamentação clínico-epidemiológica, numerosos casos suspeitos de peste nos focos brasileiros têm sido descartados por serem negativos pelo teste de hemaglutinação para detecção de anticorpos contra o antígeno F1 da Yersinia pestis. A transcendência da peste justifica estudar se tais resultados decorrem da falta de resposta ao F1, e se outras proteínas da Yersinia pestis poderiam ser reconhecidas nos soros suspeitos, sendo desta forma candidatas como alvo diagnóstico alternativo ao F1. Assim sendo, cepas de Yersinia pestis e de Yersinia pseudotuberculosis, uma proteína YopH recombinante e a F1 foram utilizadas para analisar soros de pacientes e soros imunes de coelhos. A F1 e a YopH não foram reconhecidas pelos soros humanos HA- e nenhuma proteína majoritária, comum a todos os soros humanos e coelhos, foi identificada, o que permite concluir que os casos suspeitos devem ser submetidos a uma avaliação clínico-laboratorial mais rigorosa, aprofundando a investigação epidemiológica em busca de outras etiologias