Exploring different therapeutic approaches for seizure suppression using the zebrafish model

Orientadores: Cláudia Vianna Maurer Morelli, Iscia Teresinha Lopes-CendesTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A epilepsia é uma doença neurológica caracterizada pela presença de crises epilépticas espontâneas e recorrentes que afetam em torno de 70 milhões da pessoas no mundo. Embora a grande maioria dos pacientes respondam bem ao tratamento medicamentoso, aproximadamente 30% são farmacorresistentes as drogas antiepiléptica. A farmacorresistência na epilepsia está associada a uma redução da qualidade de vida e ao aumento do risco de morte súbita. Há, portanto, uma grande necessidade de descoberta de novos compostos com propriedades anticonvulsivantes. A compreensão dos mecanismos moleculares que desencadeiam a geração da crise epiléptica é fundamental para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Nesse contexto, o presente estudo investigou o efeito de terapia anti-inflamatória, antioxidante e da hipotermia terapêutica na supressão da geração das crises epilépticas induzidas pelo agente químico convulsivante pentilenotetrazol no modelo zebrafish. Além disso, a ferramenta de edição do genoma CRISPR/Cas9 foi utilizada para criar o modelo da Doença de Lafora, uma forma de epilepsia mioclônica progressiva, com o objetivo de testar o tratamento para esta condição específica. Em conjunto, nossos dados fornecem evidências dos efeitos anticonvulsivantes de cada terapia, além de destacar como cada uma delas pode atuar para minimizar as alterações/danos associados à atividade epilépticaAbstract: Epilepsy is a neurological disease characterized by the presence of spontaneous and recurrent seizures that affect around 70 million people worldwide. Although the vast majority of patients respond well to drug therapy, approximately 30% are pharmacoresistant. Pharmacoresistance in epilepsy is associated with reduced quality of life and an increased risk of sudden death. Therefore, there is a need for the discovery of new compounds with anticonvulsant properties. The understanding of the molecular mechanisms that trigger generation of seizures is essential for the development of new therapeutic approaches. In this context, the present study investigated the effect of anti-inflammatory, antioxidative and hypothermia therapies in suppressing the generation of pentylenetetrazole-induced seizures in the zebrafish model. In addition, the CRISPR/Cas9 genome editing tool was used to create a Lafora Disease model, a form of progressive myoclonic epilepsy, in order to test anti-inflammatory compounds for this specific condition. Taken together, our data provide evidence of the anticonvulsant effects of each therapy and highlight how each therapy can act to minimize the changes/damage associated with seizure activityDoutoradoGenetica MedicaDoutora em Ciências2013/19151-9FAPES

Markers of epileptogenesis in the zebrafish seizure model

Orientador: Cláudia Vianna Maurer-MorelliDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: O Danio rerio é um peixe teleósteo popularmente conhecido como zebrafish que têm se destacado como modelo animal favorável para investigações genéticas devido à facilidade de manipulação in vivo, por sua transparência nas fases embrionária e larval e por seu desenvolvimento externo. Recentemente, foi demonstrado que o zebrafish é capaz de exibir padrão comportamental e alteração da atividade eletrográfica durante crise epiléptica como visto em roedores, tornando-o um modelo promissor para as investigações moleculares das epilepsias. Os estudos sobre os diferentes eventos já conhecidos das epilepsias no zebrafish estão apenas começando e, portanto, há ainda muito que ser investigado para uma melhor caracterização deste modelo para estudos em epilepsia. Estudos clínicos e em modelos animais mostraram que a crise epiléptica eleva os níveis da interleucina-1 beta e induz morte neuronal. Nesse sentido, o presente trabalho se propôs a investigar (i) o perfil temporal de expressão do transcrito do gene da interleucina-1 beta (il1b) no cérebro imaturo e adulto do zebrafish após a indução de crise epiléptica pelo agente químico Pentilenotetrazol por transcriptase reversa-PCR quantitativa e também, sua relação da expressão com a idade em que é realizada a indução da crise no cérebro imaturo e (ii) a morte neuronal pela histoquímica do Fluoro-Jade B (FJB) no cérebro imaturo e adulto do zebrafish após a indução de crise epiléptica pelo agente químico Pentilenotetrazol. Neste trabalho conseguimos estabelecer com sucesso as condições ideais para o acasalamento desta espécie e obtenção de embriões e, para a criação de larvas. Além disso, padronizamos o processamento histológico para a criosecção do cérebro do zebrafish. A análise temporal do transcrito do gene il1b revelou um padrão de expressão similar ao observado em roedores. A marcação por FJB não identificou inequivocadamente a presença de morte neuronal após crise epilépticaAbstract: Danio rerio is a teleost fish popular named as zebrafish that has emerged as a suitable animal model for genetic investigations due to its features such as: facility for in vivo manipulation, transparency during embryonic and larval stages and external development. Recently, It was demonstrated that larvae and adult zebrafish (Danio rerio) seizure model mimics the behavior, eletrographic and c-fos features that are well established in rodent models of epilepsy, making the zebrafish as a promising model for studying the molecular mechanisms underlying epilepsies. However, the potential of the zebrafish model for epilepsy studies has been partly described since the molecular changes and neuronal loss after seizure has not yet been investigated. Proinflammatory cytokines, such as interleukin-1beta (il1b), has shown to be upregulated in surgical specimens of pharmacoresistent patients and in experimental rodent models of seizure, however the profile of this cytokine in zebrafish model for epilepsy is unknown. For this reason, and in view of the importance of inflammatory response in the pathophysiology of epilepsy, we sought to investigate the temporal transcript profile of interleukin-1b (il1b), a proinflammatory cytokine, in adult and immature (larvae) zebrafish brain after Pentylenetetrazole-evoked seizure, as well its aged-related expression in the developing brain by reverse transcriptase-quantitative PCR and neuronal death by Fluoro-Jade B (FJB) staining in adult zebrafish brain. Zebrafish breeding was successfully established during this work as well as the protocol for histological procedures using the zebrafish brain. Our results showed a short up-regulation of il1b mRNA levels after seizure in immature and adult zebrafish brain similar as with those patterns observed in rodent models. FJB did not show a reliable neuronal death staining in the zebrafish brain after seizureMestradoCiencias BiomedicasMestra em Ciências Médica