Effective cultivation of canine Schwann cells using VEGF and FGF-2 for reconstruction of peripheral nerve lesions

Da die verschiedenen chirurgischen Versorgungsmöglichkeiten peripherer Nervenläsionen sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin oftmals zu unbefriedigenden funktionellen Ergebnissen führen, besteht die dringende Notwendigkeit neuer Behandlungsstrategien. Eine viel versprechende Alternative stellen mit Schwannzellen beladene artifizielle Nervenimplantate dar. Voraussetzung für die Entwicklung solcher Implantate für den Hund ist die Isolierung reiner caniner Schwannzell-Kulturen und deren Expansion in vitro. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer effektiven Methode zur Isolierung, Purifikation und Expansion caniner Schwannzell-Kulturen. Als Resultat der eigenen Untersuchungen wurde ein Leitschema zur Isolierung und Expansion caniner Schwannzell-Kulturen unter Einsatz von VEGF und FGF-2 entwickelt. Von insgesamt neun Hunden unterschiedlichen Alters wurden unmittelbar nach dem Tod Biopsien des N. radialis und des N. ischiadicus in einer Länge von ca. vier cm entnommen. Das Nervengewebe wurde unter sterilen Bedingungen präpariert und in ein bis zwei mm große Explantate zerteilt. Vergleichend wurde die Kultivierung der Explantate in serumhaltigem DMEM+ und serumfreiem MM+ erprobt, wobei sich in dieser Phase der Einsatz von DMEM+ empfahl. Die Nervenexplantate wurden wöchentlich passagiert und nach 21 Tagen mit einem Verdauungsansatz bestehend aus Hyaluronidase, Kollagenase, DNase und Trypsin enzymatisch dissoziiert. Aus den so erhaltenen Mischkulturen wurden mit Hilfe wiederholter kurzzeitiger Trypsinierungen und Inkubation der Kulturen in MM+ effektiv reine Schwannzell- Kulturen gewonnen. Die immunzytochemische Identifizierung der Schwannzellen sowohl in vitro als auch in situ im histologischen Schnitt caninen Nervengewebes erfolgte mit dem für canine Schwannzellen etablierten p75-NTR-Antikörper, welcher Schwannzellen, nicht aber Fibroblasten markiert. Der proliferative Effekt von VEGF und FGF-2 wurde in den purifizierten und kryokonservierten Schwannzell-Kulturen untersucht. Alle Versuche wurden sechsfach angesetzt und dreimal wiederholt. Die quantitative Analyse der proliferativen Wirkung erfolgte stets parallel mit Hilfe des BrdU-Assay und des Resazurin-Resorufin-Assay. Zunächst wurde der proliferationsfördernde Effekt von VEGF und FGF-2 in den Konzentrationen 5 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml und 100 ng/ml im Vergleich zu DMEM+ ohne den Zusatz von Wachstumsfaktoren (Negativkontrolle) separat voneinander untersucht. Obwohl die absoluten Zellzahlen starken Schwankungen unterlagen, war bei beiden Wachstumsfaktoren mit beiden verwendeten Proliferations-Assays in allen Versuchsdurchgängen, den arithmetischen Mittelwert betrachtend, mit zunehmender Konzentration von VEGF und FGF-2 bis 50 ng/ml ein Anstieg der ermittelten logarithmischen Zellzahl (lgZZ) messbar. Eine weitere Steigerung der Wachstumsfaktor-Konzentration auf 100 ng/ml brachte keine Zunahme der Zellzahl. Sowohl VEGF als auch FGF-2 hatten in der Konzentration 50 ng/ml in DMEM+ den stärksten Effekt auf die Proliferation caniner Schwannzellen. Außerdem wurden bei Kultivierung der caninen Schwannzellen in 50 ng/ml FGF-2 signifikant höhere Zellzahlen erzielt als bei Inkubation in 50 ng/ml VEGF. Deshalb muss zur effektiveren Kultivierung caniner Schwannzellen dem Einsatz von 50 ng/ml FGF-2 gegenüber der Inkubation der Zellen in 50 ng/ml VEGF der Vorzug gegeben werden. Da beim separaten Einsatz von VEGF und FGF-2 eine Konzentration von 5 ng/ml nur in einem einzigen Fall eine signifikant höhere lgZZ im Vergleich zur Negativkontrolle aufwies, wurden die Wachstumsfaktoren in den Konzentrationen 10 ng/ml, 50 ng/ml und 100 ng/ml in DMEM+ in jeder Möglichkeit mit einander kombiniert. Als Negativkontrolle wurden auch in diesen Versuchen Schwannzellen mit reinem DMEM+ inkubiert. Mit beiden Proliferations-Assays wurde im arithmetischen Mittel die höchste Anzahl caniner Schwannzellen in drei Versuchsansätzen mit der Kombination von 10 ng/ml VEGF und 50 ng/ml FGF-2 und in den anderen drei Versuchsansätzen mit 10 ng/ml VEGF und 100 ng/ml FGF-2 erzielt. Nur in einem einzigen Versuch wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den arithmetischen Mittelwerten der lgZZ der in 10 ng/ml VEGF in Kombination mit 100 ng/ml FGF-2 inkubierten Schwannzellen im Vergleich zu den Negativkontrollen festgestellt. Verglichen mit der separaten Kultivierung der Schwannzellen in 50 ng/ml VEGF oder 50 ng/ml FGF-2 führte keine der gewählten Kombinationen aus beiden Wachstumsfaktoren zu einer signifikant höheren lgZZ. In der vorliegenden Arbeit wurde eine effektive Methode zur Isolierung, Purifikation und Expansion caniner Schwannzellen unter Anwendung von VEGF und FGF-2 entwickelt. Ob sich die Proliferation caniner Schwannzellen in vitro durch andere Wachstumsfaktoren noch optimieren lässt, ist in weiteren Untersuchungen herauszufinden. Vor einem klinischen Einsatz in vitro kultivierter caniner Schwannzellen in artifiziellen Nervenimplantaten sollten diese außerdem unbedingt hinsichtlich ihrer Funktionalität und ihres Transformationspotentials untersucht werden.Current surgical techniques to restore normal peripheral nerve function remain unsatisfying in veterinary as well as in human medicine, indicating a need for new treatment strategies. Schwann cell coated tubular implants present one promising option. The development of such artificial grafts for the dog requires the isolation and in vitro expansion of pure canine Schwann cell cultures. The study aimed to establish an effective method for isolation, purification and expansion of canine Schwann cell cultures. The research results produced a guideline for such isolation, purification and expansion with the help of VEGF and FGF-2. Nerve biopsies from nine dogs of different ages were extracted from the N. radialis and N. ischiadicus directly after euthanasia. The biopsy length was about four cm. Nerves were prepared under sterile conditions and cut into pieces of one to two mm. Comparing serum added DMEM+ and serumfree MM+ as media for cultivation, serum added DMEM+ is recommended in this stage. The explants were passaged weekly and dissociated after 21 days with a digestion medium containing hyaluronidase (0.1%), collagenase (0.1%), DNase (0.1%) and trypsin. Mixed cell cultures were obtained after dissociation. Pure cultures of canine Schwann cells were gained by repeated short trypsination and incubation in MM+. Schwann cells in vitro and in situ were identified by immunolabeling with an established antibody to p75-NTR, which marks Schwann cells but not fibroblasts. The proliferative effect of VEGF and FGF-2 was examined in the purified and cryoconserved Schwann cell cultures. All experiments were done six-fold and repeated three times. Quantitative analyses of the proliferative effect were done using two different detection systems, the BrdU assay and the Resazurin-Resorufin assay. First the proliferative effect of VEGF and FGF-2 was tested separately in the concentrations of 5 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml and 100 ng/ml, and compared to DMEM+ without growth factors (the negative control). Despite high variabilities of the absolute cell counts, an increase in arithmetic mean of the logarithmic cell count (lgCC) with increasing concentrations of VEGF and FGF-2 up to 50 ng/ml was detected in both proliferation assays and in all passages, for both growth factors. An enhancement in growth factor concentration of up to 100 ng/ml did not lead to higher amounts of Schwann cells. Concentrations of 50 ng/ml in both VEGF and FGF-2 contained the strongest proliferative effect on canine Schwann cells. Furthermore, incubation of canine Schwann cells in 50 ng/ml FGF-2 resulted in a significantly higher cell count compared to incubation in 50 ng/ml of VEGF. Therefore, cultivation of canine Schwann cells in 50 ng/ml FGF-2 recommends itself. Separate Schwann cells in 50 ng/ml FGF-2 concentrations of 5 ng/ml lead to a significantly higher lgCC in only one of the cases compared to the negative control group. Due to this effect, the growth factor concentrations of 10 ng/ml, 50 ng/ml and 100 ng/ml in DMEM+ were combined in each possible iteration. The negative control group of canine Schwann cells were incubated in DMEM+ again. The highest arithmetic mean of canine Schwann cells for both proliferation assays was reached with 10 ng/ml VEGF combined with 50 ng/ml FGF-2 in three of the cases, and with 10 ng/ml VEGF combined with 100 ng/ml FGF-2 in the three remaining cases. A significant difference in the lgCC between incubation in 10 ng/ml VEGF and 100 ng/ml FGF-2 and incubation in the negative control group was only detected in one case. None of the combinations used led to a significantly higher lgCC compared to incubation of Schwann cells in 50 ng/ml FGF-2. The incubation in 50 ng/ml VEGF or in 50 ng/ml FGF-2 is recommended over other tested combinations for effective cultivation of canine Schwann cells. The study developed an effective method for isolation, purification and expansion of canine Schwann cells including VEGF and FGF-2. Further examination is required to determine whether the proliferation of canine Schwann cells in vitro can be optimized by other growth factors. Before such in vitro cultivated Schwann cells can be used in artificial transplants, their functionality and transformation potential also need to be tested