Regulation of proteostasis functional units in aging and cancer

The integrity of proteome homeodynamics (or proteostasis) is critical for cell homeostasis and viability. Thus, organisms have developed several defense mechanisms in order to inspect the basal functionality and structure of cellular biomolecules and hence avoid proteotoxic stress. The maintenance of proteome functionality and stability along with the clearance of proteome damage are orchestrated by a highly integrated modular system, which is called the proteostasis network. Key elements are the two main degradation pathways, namely the ubiquitin-proteasome and the autophagy-lysosome pathway. Multiple myeloma (MM), a typical proteome instability disease, is a hematologic malignancy that results from B lymphocytes transformation into a clone of pathological plasma cells. A promising therapeutic approach employs specific inhibitors against 20S proteasome activities such as Bortezomib and Carfilzomib. Despite the fact that proteasome inhibitors (PIs) have improved significantly overall survival of MM patients, severe side effects such as peripheral neuropathy and cardiotoxicity adversely affect life quality of patients. Herein, we investigated proteasome activity levels in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and red blood cells (RBCs) during aging, as well as the molecular basis and regulation of proteasome functional units in MM patients following treatment with PIs. We also studied proteasome regulation during aging in cardiac tissue using Drosophila melanogaster as a model organism. The effect of proteasome inhibition on the cardiac tissue and function was also examined. We found that our observations in MM patients largely recapitulate the findings in the fly model indicating that Drosophila represents a unique in vivo experimental platform for studying proteostatic modules functionality during normal aging and in diseases. Of particular interest is our finding that despite treatment with PIs, the PBMCs, and interestingly RBCs of several patients expressed elevated proteasomal activities during therapy. In the case of PBMCs these responses may relate to gene expression alterations in order to surpass the inhibitory effects of the PIs. In the case of the anucleated RBCs higher proteasome activities may relate to increased clearance of damaged RBCs via erythrophagocytosis that may lead to bone marrow-mediated increased erythropoiesis or proteasome load in newly produced RBCs. Our studies in the fly model indicated that aged heart tissue is characterized by significant proteasome activity reduction, accumulation of proteome instability, as well as cardiac dysfunction probably due to proteostasis network disruption. We also observed that β1, but mainly β5 subunits are essential for developmental stages in Drosophila flies, probably due to the fact that heart fails to pump hemolymph, a liquid enriched with hormones, peptide and nutrients, to other tissues. In addition, proteome imbalance caused by proteasome knock down specifically in heart led to mitochondrial disorder resulting in cardiac dysfunction. Moreover, over-expression of Atg8a protein in the Prosβ5RNAi background reduced proteotoxic stress in heart and induced mitochondrial biogenesis by activation of the autophagy-lysosome pathway and hence mitophagy. Mitophagy as a process aims to degrade damaged mitochondria and restore cellular mitochondrial homeostasis. At the same time, prolonged exposure to either Bortezomib or Carfilzomib caused in insects’ tissues proteome instability, with severe effects on mitochondrial function and consequently on heart, causing arrhythmia and bradycardia. Metformin and Rapamycin administration alleviated the phenotype caused by PIs via induction of autophagy-lysosome pathway. In conclusion, the mitochondrial health and hence heart functionality is (among others) regulated by the interplay between mitochondria biogenesis and mitophagy, a communication which can be disrupted after proteasome dysfunction.Η ομοιόσταση του πρωτεώματος (πρωτεόσταση) είναι κρίσιμη για την κυτταρική λειτουργικότητα και συνεπώς για την υγεία του οργανισμού η οποία εξασφαλίζεται από το δίκτυο πρωτεόστασης. Βασικά στοιχεία του δικτύου αποτελούν τα δύο κύρια πρωτεoλυτικά συστήματα ουβικιτίνης-πρωτεασώματος και αυτοφαγίας-λυσοσώματος. Αρκετά στοιχεία υποδηλώνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν υψηλή εξάρτηση από τους μηχανισμούς πρωτεόστασης συμπεριλαμβανομένου και του μονοπατιού ουβικιτίνης-πρωτεασώματος. Το πολλαπλούν μυέλωμα, μια κλασική νόσος πρωτεωμικής αστάθειας, αποτελεί μια αιματολογική κακοήθεια που προκύπτει από το μετασχηματισμό των Β-λεμφοκυττάρων σε κλώνο παθολογικών πλασματοκυττάρων. Μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση είναι αυτή της στόχευσης του πρωτεασώματος με τη χρήση διαφόρων αναστολέων έναντι αυτού όπως το Bortezomib και το Carfilzomib.Οι αναστολείς πρωτεασώματος παρόλο που έχουν βελτιώσει σημαντικά την ολική επιβίωση των ασθενών που πάσχουν από πολλαπλούν μυέλωμα, εμφανίζουν σοβαρές παρενέργειες όπως καρδιοτοξικότητα Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή αφορά στη μελέτη των μεταβολών της ενεργότητας του πρωτεασώματος σε κύτταρα περιφερικού αίματος κατά τη γήρανση καθώς και στην κατανόηση της μοριακής βάσης και ρύθμισης των λειτουργικών μονάδων πρωτεόστασης (πρωτεάσωμα) σε ασθενείς με πολλαπλούν μυέλωμα μετά από θεραπεία με πρωτεασωμικούς αναστολείς. Επίσης μέρος της εργασίας είναι η μελέτη της ρύθμισης του πρωτεασώματος κατά τη γήρανση στον καρδιακό ιστό. Ως μοντέλο επιλέχθηκε η Drosophila melanogaster. Στο ίδιο σύστημα μελετήθηκε η επίδραση της μερικής πρωτεασωμικής αναστολής στην καρδιακή λειτουργία καθώς η καρδιοτοξικότητα είναι σημαντική παρενέργεια των πρωτεασωμικών αναστολέων. Επίσης θεματική περιοχή της παρούσας εργασίας αποτελεί η ανάδειξη θεραπευτικών παρεμβάσεων για τη μείωση της καρδιοτοξικότητας, η οποία σχετίζεται με τη μερική αναστολή της πρωτεασωμικής λειτουργίας στον καρδιακό ιστό. Οι παρατηρήσεις μας εν συντομία έδειξαν μείωση της πρωτεασωμικής ενεργότητας κατά το γήρας σε κύτταρα του περιφερικού αίματος. Η επίδραση των πρωτεασωμικών αναστολέων στα μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος (ΜΚΠΑ) οδήγησε στην αύξηση της έκφρασης πρωτεοστατικών γονιδίων στους περισσότερους ασθενείς, πιθανώς προκειμένου το κύτταρο να εξισορροπήσει τη δυσλειτουργία του πρωτεασώματος (δίκτυο ανάδρασης). Παρά τη θεραπεία με αναστολείς πρωτεασώματος, τα ΜΚΠΑ, αλλά και τα ερυθροκύτταρα (ΕΚ), κάποιων ασθενών παρουσίασαν αυξημένες πρωτεασωμικές ενεργότητες. Στην περίπτωση των ΜΚΠΑ οι αποκρίσεις αυτές μπορεί να σχετίζονται με μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης. Η αύξηση της πρωτεασωμικής ενζυμικής ενεργότητας στα ΕΚ (κύτταρα απύρηνα) ενδεχομένως αποδίδεται στη σύνθεση περισσότερων νέων ΕΚ από το μυελό των οστών (αιμοποίηση). Είδαμε επίσης πως γηρασμένος καρδιακός ιστός χαρακτηρίζεται από μειωμένη πρωτεασωμική ενεργότητα και αυξημένη πρωτεωμική αστάθεια καθώς και καρδιακή δυσλειτουργία πιθανώς εξαιτίας της διαταραχής του δικτύου πρωτεόστασης. Ακολούθως παρατηρήσαμε πως οι πρωτεασωμικές υπομονάδες β1 (ενεργότητα κασπάσης) αλλά κυρίως η β5 (ενεργότητα χυμοθρυψίνης) είναι βασικές για την ανάπτυξη των εντόμων Drosophila melanogaster πιθανότατα εξαιτίας της καρδιακής δυσλειτουργίας και της δυσκολίας στη μετακίνηση θρεπτικών στοιχείων στους ιστούς. H αποσιώπηση των συγκεκριμένων υπομονάδων προκαλεί πρωτεοτοξικό στρες στον καρδιακό ιστό και διαταραχή της μιτοχονδριακής λειτουργίας οδηγώντας σε καρδιακή δυσλειτουργία. H υπερέκφραση της αυτοφαγικής πρωτεΐνης Atg8a σε υπόβαθρο β5 RNAi μειώνει το πρωτεοτοξικό στρες στην καρδιά, και επάγει τη βιογένεση των μιτοχονδρίων μέσω επαγωγής του μονοπατιού αυτοφαγίας-λυσοσώματος και της αποκατάστασης της μιτόστασης. Ταυτόχρονα, η παρατεταμένη έκθεση εντόμων σε Bortezomib και Carfilzomib προκάλεσε πρωτεωμική αστάθεια, με σοβαρές επιπτώσεις στη λειτουργία των μιτοχονδρίων αλλά και της καρδιάς προκαλώντας αρρυθμία και βραδυκαρδία. Η χορήγηση των επαγωγέων αυτοφαγίας μετφορμίνη και ραπαμυκίνη οδήγησε σε βελτίωση του φαινοτύπου που προκλήθηκε από τους πρωτεασωμικούς αναστολείς και σε αυτήν την περίπτωση μέσω επαγωγής του μονοπατιού της αυτοφαγίας-λυσοσώματος. Συμπερασματικά, η υγεία των μιτοχονδρίων και κατ’ επέκταση της καρδιάς ρυθμίζεται από την ισορροπία μεταξύ βιογένεσης και μιτοφαγίας, μιας διαδικασίας μέσω της οποίας τα κατεστραμμένα μιτοχόνδρια υποβάλλονται σε αυτοφαγική αποικοδόμηση

Μελέτη της ρύθμισης λειτουργικών μονάδων του δικτύου κυτταρικής πρωτεόστασης στη γήρανση και τον καρκίνο

Η ομοιόσταση του πρωτεώματος (πρωτεόσταση) είναι κρίσιμη για την κυτταρική λειτουργικότητα και συνεπώς για την υγεία του οργανισμού η οποία εξασφαλίζεται από το δίκτυο πρωτεόστασης. Βασικά στοιχεία του δικτύου αποτελούν τα δύο κύρια πρωτεoλυτικά συστήματα ουβικιτίνης-πρωτεασώματος και αυτοφαγίας-λυσοσώματος. Αρκετά στοιχεία υποδηλώνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν υψηλή εξάρτηση από τους μηχανισμούς πρωτεόστασης συμπεριλαμβανομένου και του μονοπατιού ουβικιτίνης-πρωτεασώματος. Το πολλαπλούν μυέλωμα, μια κλασική νόσος πρωτεωμικής αστάθειας, αποτελεί μια αιματολογική κακοήθεια που προκύπτει από το μετασχηματισμό των Β-λεμφοκυττάρων σε κλώνο παθολογικών πλασματοκυττάρων. Μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση είναι αυτή της στόχευσης του πρωτεασώματος με τη χρήση διαφόρων αναστολέων έναντι αυτού όπως το Bortezomib και το Carfilzomib. Οι αναστολείς πρωτεασώματος παρόλο που έχουν βελτιώσει σημαντικά την ολική επιβίωση των ασθενών που πάσχουν από πολλαπλούν μυέλωμα, εμφανίζουν σοβαρές παρενέργειες όπως καρδιοτοξικότητα Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή αφορά στη μελέτη των μεταβολών της ενεργότητας του πρωτεασώματος σε κύτταρα περιφερικού αίματος κατά τη γήρανση καθώς και στην κατανόηση της μοριακής βάσης και ρύθμισης των λειτουργικών μονάδων πρωτεόστασης (πρωτεάσωμα) σε ασθενείς με πολλαπλούν μυέλωμα μετά από θεραπεία με πρωτεασωμικούς αναστολείς. Επίσης μέρος της εργασίας είναι η μελέτη της ρύθμισης του πρωτεασώματος κατά τη γήρανση στον καρδιακό ιστό. Ως μοντέλο επιλέχθηκε η Drosophila melanogaster. Στο ίδιο σύστημα μελετήθηκε η επίδραση της μερικής πρωτεασωμικής αναστολής στην καρδιακή λειτουργία καθώς η καρδιοτοξικότητα είναι σημαντική παρενέργεια των πρωτεασωμικών αναστολέων. Επίσης θεματική περιοχή της παρούσας εργασίας αποτελεί η ανάδειξη θεραπευτικών παρεμβάσεων για τη μείωση της καρδιοτοξικότητας, η οποία σχετίζεται με τη μερική αναστολή της πρωτεασωμικής λειτουργίας στον καρδιακό ιστό. Οι παρατηρήσεις μας εν συντομία έδειξαν μείωση της πρωτεασωμικής ενεργότητας κατά το γήρας σε κύτταρα του περιφερικού αίματος. Η επίδραση των πρωτεασωμικών αναστολέων στα μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος (ΜΚΠΑ) οδήγησε στην αύξηση της έκφρασης πρωτεοστατικών γονιδίων στους περισσότερους ασθενείς, πιθανώς προκειμένου το κύτταρο να εξισορροπήσει τη δυσλειτουργία του πρωτεασώματος (δίκτυο ανάδρασης). Παρά τη θεραπεία με αναστολείς πρωτεασώματος, τα ΜΚΠΑ, αλλά και τα ερυθροκύτταρα (ΕΚ), κάποιων ασθενών παρουσίασαν αυξημένες πρωτεασωμικές ενεργότητες. Στην περίπτωση των ΜΚΠΑ οι αποκρίσεις αυτές μπορεί να σχετίζονται με μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης. Η αύξηση της πρωτεασωμικής ενζυμικής ενεργότητας στα ΕΚ (κύτταρα απύρηνα) ενδεχομένως αποδίδεται στη σύνθεση περισσότερων νέων ΕΚ από το μυελό των οστών (αιμοποίηση). Είδαμε επίσης πως γηρασμένος καρδιακός ιστός χαρακτηρίζεται από μειωμένη πρωτεασωμική ενεργότητα και αυξημένη πρωτεωμική αστάθεια καθώς και καρδιακή δυσλειτουργία πιθανώς εξαιτίας της διαταραχής του δικτύου πρωτεόστασης. Ακολούθως παρατηρήσαμε πως οι πρωτεασωμικές υπομονάδες β1 (ενεργότητα κασπάσης) αλλά κυρίως η β5 (ενεργότητα χυμοθρυψίνης) είναι βασικές για την ανάπτυξη των εντόμων Drosophila melanogaster πιθανότατα εξαιτίας της καρδιακής δυσλειτουργίας και της δυσκολίας στη μετακίνηση θρεπτικών στοιχείων στους ιστούς. H αποσιώπηση των συγκεκριμένων υπομονάδων προκαλεί πρωτεοτοξικό στρες στον καρδιακό ιστό και διαταραχή της μιτοχονδριακής λειτουργίας οδηγώντας σε καρδιακή δυσλειτουργία. H υπερέκφραση της αυτοφαγικής πρωτεΐνης Atg8a σε υπόβαθρο β5 RNAi μειώνει το πρωτεοτοξικό στρες στην καρδιά, και επάγει τη βιογένεση των μιτοχονδρίων μέσω επαγωγής του μονοπατιού αυτοφαγίας-λυσοσώματος και της αποκατάστασης της μιτόστασης. Ταυτόχρονα, η παρατεταμένη έκθεση εντόμων σε Bortezomib και Carfilzomib προκάλεσε πρωτεωμική αστάθεια, με σοβαρές επιπτώσεις στη λειτουργία των μιτοχονδρίων αλλά και της καρδιάς προκαλώντας αρρυθμία και βραδυκαρδία. Η χορήγηση των επαγωγέων αυτοφαγίας μετφορμίνη και ραπαμυκίνη οδήγησε σε βελτίωση του φαινοτύπου που προκλήθηκε από τους πρωτεασωμικούς αναστολείς και σε αυτήν την περίπτωση μέσω επαγωγής του μονοπατιού της αυτοφαγίας-λυσοσώματος. Συμπερασματικά, η υγεία των μιτοχονδρίων και κατ’ επέκταση της καρδιάς ρυθμίζεται από την ισορροπία μεταξύ βιογένεσης και μιτοφαγίας, μιας διαδικασίας μέσω της οποίας τα κατεστραμμένα μιτοχόνδρια υποβάλλονται σε αυτοφαγική αποικοδόμηση.The integrity of proteome homeodynamics (or proteostasis) is critical for cell homeostasis and viability. Thus, organisms have developed several defense mechanisms in order to inspect the basal functionality and structure of cellular biomolecules and hence avoid proteotoxic stress. The maintenance of proteome functionality and stability along with the clearance of proteome damage are orchestrated by a highly integrated modular system, which is called the proteostasis network. Key elements are the two main degradation pathways, namely the ubiquitin-proteasome and the autophagy-lysosome pathway. Multiple myeloma (MM), a typical proteome instability disease, is a hematologic malignancy that results from B lymphocytes transformation into a clone of pathological plasma cells. A promising therapeutic approach employs specific inhibitors against 20S proteasome activities such as Bortezomib and Carfilzomib Despite the fact that proteasome inhibitors (PIs) have improved significantly overall survival of MM patients, severe side effects such as peripheral neuropathy and cardiotoxicity adversely affect life quality of patients. Herein, we investigated proteasome activity levels in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and red blood cells (RBCs) during aging, as well as the molecular basis and regulation of proteasome functional units in MM patients following treatment with PIs. We also studied proteasome regulation during aging in cardiac tissue using Drosophila melanogaster as a model organism. The effect of proteasome inhibition on the cardiac tissue and function was also examined. We found that our observations in MM patients largely recapitulate the findings in the fly model indicating that Drosophila represents a unique in vivo experimental platform for studying proteostatic modules functionality during normal aging and in diseases. Of particular interest is our finding that despite treatment with PIs, the PBMCs, and interestingly RBCs of several patients expressed elevated proteasomal activities during therapy. In the case of PBMCs these responses may relate to gene expression alterations in order to surpass the inhibitory effects of the PIs. In the case of the anucleated RBCs higher proteasome activities may relate to increased clearance of damaged RBCs via erythrophagocytosis that may lead to bone marrow-mediated increased erythropoiesis or proteasome load in newly produced RBCs. Our studies in the fly model indicated that aged heart tissue is characterized by significant proteasome activity reduction, accumulation of proteome instability, as well as cardiac dysfunction probably due to proteostasis network disruption. We also observed that β1, but mainly β5 subunits are essential for developmental stages in Drosophila flies, probably due to the fact that heart fails to pump hemolymph, a liquid enriched with hormones, peptide and nutrients, to other tissues. In addition, proteome imbalance caused by proteasome knock down specifically in heart led to mitochondrial disorder resulting in cardiac dysfunction. Moreover, over-expression of Atg8a protein in the Prosβ5RNAi background reduced proteotoxic stress in heart and induced mitochondrial biogenesis by activation of the autophagy-lysosome pathway and hence mitophagy. Mitophagy as a process aims to degrade damaged mitochondria and restore cellular mitochondrial homeostasis. At the same time, prolonged exposure to either Bortezomib or Carfilzomib caused in insects’ tissues proteome instability, with severe effects on mitochondrial function and consequently on heart, causing arrhythmia and bradycardia. Metformin and Rapamycin administration alleviated the phenotype caused by PIs via induction of autophagy-lysosome pathway. In conclusion, the mitochondrial health and hence heart functionality is (among others) regulated by the interplay between mitochondria biogenesis and mitophagy, a communication which can be disrupted after proteasome dysfunction

Milder degenerative effects of Carfilzomib vs. Bortezomib in the Drosophila model: a link to clinical adverse events

Proteasome inhibitors, e.g. Bortezomib (BTZ) and Carfilzomib (CFZ), have demonstrated clinical efficacy against haematological cancers. Interestingly, several adverse effects are less common, compared to BTZ, in patients treated with CFZ. As the molecular details of these observations remain not well understood we assayed the pathophysiological effects of CFZ vs. BTZ in the Drosophila experimental model. Mass Spectrometry analyses showed that neither CFZ nor BTZ are hydrolysed in flies' tissues, while at doses inducing similar inhibition of the rate limiting for protein breakdown chymotrypsin-like (CT-L) proteasomal activity, CFZ treatment resulted in less intense increase of oxidative stress or activation of antioxidant and proteostatic modules. Also, despite comparable cardiotoxicity likely due to disrupted mitochondrial function, CFZ did not affect developmental processes, showed minimal neuromuscular defects and reduced to a lesser extent flies' healthspan. Studies in flies, human cancer cell lines and blood cells isolated from Multiple Myeloma patients treated with CFZ or BTZ revealed, that the increased BTZ toxicity likely relates to partial co-inhibition of the caspase-like (C-L) proteasomal activity Supportively, co-treating flies with CFZ and a C-L selective proteasome inhibitor exacerbated CFZ-mediated toxicity. Our findings provide a reasonable explanation for the differential adverse effects of CFZ and BTZ in the clinic. © 2017 The Author(s)

Molecular responses to therapeutic proteasome inhibitors in multiple myeloma patients are donor-, cell type-and drug-dependent

Proteasome is central to proteostasis network functionality and its overactivation represents a hallmark of advanced tumors; thus, its selective inhibition provides a strategy for the development of novel antitumor therapies. In support, proteasome inhibitors, e.g. Bortezomib or Carfilzomib have demonstrated clinical efficacy against hematological cancers. Herein, we studied proteasome regulation in peripheral blood mononuclear cells and erythrocytes isolated from healthy donors or from Multiple Myeloma patients treated with Bortezomib or Carfilzomib. In healthy donors we found that peripheral blood mononuclear cells express higher, as compared to erythrocytes, basal proteasome activities, as well as that proteasome activities decline during aging. Studies in cells isolated from Multiple Myeloma patients treated with proteasome inhibitors revealed that in most (but, interestingly enough, not all) patients, proteasome activities decline in both cell types during therapy. In peripheral blood mononuclear cells, most proteostatic genes expression patterns showed a positive correlation during therapy indicating that proteostasis network modules likely respond to proteasome inhibition as a functional unit. Finally, the expression levels of antioxidant, chaperone and aggresomes removal/autophagy genes were found to inversely associate with patients' survival. Our studies will support a more personalized therapeutic approach in hematological malignancies treated with proteasome inhibitors. © Papanagnou et al