Maturation des cellules dendritiques dans un objectif d'essai thérapeutique anti-tumoral

L'immunothérapie des cancers utilisant les cellules dendritiques (DC) est une approchethérapeutique qui, depuis plusieurs années, a été évaluée dans de nombreux essais cliniques. Cette stratégiede vaccination anti-tumorale est basée sur les propriétés particulières des DC décrites comme étant lesmeilleures cellules présentatrices d'antigènes et activatrices de réponses immunitaires innées ou acquises.Cependant, l’efficacité thérapeutique anti-tumorale de ces cellules est très loin de répondre aux espoirssuscités. Une critique des protocoles d’immunothérapie serait alors nécessaire, afin d’améliorer et destandardiser la manipulation ex vivo des DC, avant d’être réinjectées au patient.Au cours de mon travail, j'ai tout d'abord évalué et comparé différents protocoles deproduction de DC, issues de monocytes humains, dans le cadre de leur utilisation en clinique. Latechnique de purification sélectionnée est l'élutriation, qui permet la purification des monocytes parcentrifugation dans un flux liquide à contre-courant. A partir de ces cellules purifiées, j'ai ensuite testéplusieurs conditions d'activation et de maturation de ces cellules, paramètres d'importance pour labonne efficacité thérapeutique. J'ai ainsi sélectionné un milieu de grade « clinique », le RPMI-2% AH,et un cocktail d’agents pour la maturation des DC (Poly I:C/TNF_/IL-1_). Dans la seconde partie demon travail, j'ai adapté deux protocoles d’induction de mort de cellules tumorales en vue d’unchargement des DC en antigènes de tumeur pour induire une réponse lymphocytaire T spécifique. Eneffet, il est maintenant reconnu que l'apoptose est capable de générer différentes réponses selon lemode d'induction de cette mort particulière. J'ai ainsi comparé deux protocoles, développés au sein del'équipe de recherche, l'un par traitement de cellules tumorales par des inhibiteurs d'histonedéacétylase, l'autre par infection par le vaccin contre la rougeole. Dans un premier temps, j’ai adapté laculture et la mort des cellules tumorales dans un milieu appauvrit en sérum de veau foetal (SVF),milieu protéique animal qui n'est pas adapté ni validé pour la thérapie chez l'homme. J'ai ensuite testéle rôle de l'apoptose selon les deux modes d'induction possibles, sur le comportement et la maturationdes DC. Une maturation spontanée mais partielle des DC a été observée avec le protocole d’inductionde mort par infection virale, caractérisée par l’expression du CD83 et l’augmentation de l’expressiondu CD80 et du CD86. J’ai également mis en évidence la capacité de migration des DC ainsi que leurcapacité d’activation des lymphocytes T CD4+ naïfs. Cependant, aucune augmentation de l’expressiondu CD40 ni de sécrétion d’IL-10 et d’IL-12, ne sont observées. L’immunothérapie par DC seraprobablement utilisée prochainement en routine en clinique, cependant un meilleur contrôle de lamanipulation des cellules ex vivo et l’élimination totale du SVF, semblent indispensables au préalable

Maturation des cellules dendritiques dans un objectif d'essai thérapeutique anti-tumoral

L'immunothérapie des cancers utilisant les cellules dendritiques (DC) est une approchethérapeutique qui, depuis plusieurs années, a été évaluée dans de nombreux essais cliniques. Cette stratégiede vaccination anti-tumorale est basée sur les propriétés particulières des DC décrites comme étant lesmeilleures cellules présentatrices d'antigènes et activatrices de réponses immunitaires innées ou acquises.Cependant, l’efficacité thérapeutique anti-tumorale de ces cellules est très loin de répondre aux espoirssuscités. Une critique des protocoles d’immunothérapie serait alors nécessaire, afin d’améliorer et destandardiser la manipulation ex vivo des DC, avant d’être réinjectées au patient.Au cours de mon travail, j'ai tout d'abord évalué et comparé différents protocoles deproduction de DC, issues de monocytes humains, dans le cadre de leur utilisation en clinique. Latechnique de purification sélectionnée est l'élutriation, qui permet la purification des monocytes parcentrifugation dans un flux liquide à contre-courant. A partir de ces cellules purifiées, j'ai ensuite testéplusieurs conditions d'activation et de maturation de ces cellules, paramètres d'importance pour labonne efficacité thérapeutique. J'ai ainsi sélectionné un milieu de grade « clinique », le RPMI-2% AH,et un cocktail d’agents pour la maturation des DC (Poly I:C/TNF_/IL-1_). Dans la seconde partie demon travail, j'ai adapté deux protocoles d’induction de mort de cellules tumorales en vue d’unchargement des DC en antigènes de tumeur pour induire une réponse lymphocytaire T spécifique. Eneffet, il est maintenant reconnu que l'apoptose est capable de générer différentes réponses selon lemode d'induction de cette mort particulière. J'ai ainsi comparé deux protocoles, développés au sein del'équipe de recherche, l'un par traitement de cellules tumorales par des inhibiteurs d'histonedéacétylase, l'autre par infection par le vaccin contre la rougeole. Dans un premier temps, j’ai adapté laculture et la mort des cellules tumorales dans un milieu appauvrit en sérum de veau foetal (SVF),milieu protéique animal qui n'est pas adapté ni validé pour la thérapie chez l'homme. J'ai ensuite testéle rôle de l'apoptose selon les deux modes d'induction possibles, sur le comportement et la maturationdes DC. Une maturation spontanée mais partielle des DC a été observée avec le protocole d’inductionde mort par infection virale, caractérisée par l’expression du CD83 et l’augmentation de l’expressiondu CD80 et du CD86. J’ai également mis en évidence la capacité de migration des DC ainsi que leurcapacité d’activation des lymphocytes T CD4+ naïfs. Cependant, aucune augmentation de l’expressiondu CD40 ni de sécrétion d’IL-10 et d’IL-12, ne sont observées. L’immunothérapie par DC seraprobablement utilisée prochainement en routine en clinique, cependant un meilleur contrôle de lamanipulation des cellules ex vivo et l’élimination totale du SVF, semblent indispensables au préalable

Purification of circulating plasmacytoid dendritic cells using counterflow centrifugal elutriation and immunomagnetic beads

International audienceBACKGROUND AIMS:Plasmacytoid dendritic cells (pDC) are a dendritic cell (DC) subset specialized in the production of high amounts of interferon (IFN) type I (IFN-α, -β) in response to viruses. They can be purified from peripheral blood mononuclear cells (PBMC), usually using magnetic bead sorting.METHODS:In this study, we set up a counterflow centrifugal elutriation (CCE) procedure to enrich pDC from PBMC. We first analyzed each CCE fraction for the presence of pDC using CD123 and BDCA-2 as markers. We then purified pDC using CCE and magnetic beads and verified that their functions were not affected by this procedure.RESULTS:pDC were sorted by CCE into intermediate fractions between those containing lymphocytes and monocytes. The pDC frequency in these intermediate fractions was 3-fold that in PBMC. Using negative-magnetic bead sorting, starting with the same number of cells and beads, we obtained more than twice as many pDC from intermediate fractions as from PBMC. The phenotypes and IFN-α production capacities of sorted pDC from PBMC and from intermediate fractions were similar, both immediately after sorting and after stimulation with CpG-A oligodeoxynucleotides. In addition, we showed that intermediate fractions could be cryopreserved and that magnetic bead sorting could be performed with the same efficiency after thawing.CONCLUSIONS:Altogether, our results show that CCE can be used to enrich lymphocytes, monocytes and pDC from the same donor, without magnetic beads on their surface. Our method should be useful for the purification of these cells for experimental research and may also be adaptable for clinical use in immunotherapy

Modulation of the Type I Interferon Response Defines the Sensitivity of Human Melanoma Cells to Oncolytic Measles Virus

International audienceBackground: Oncolytic viruses such as live-attenuated, vaccine strains of measles virus (MV) have recently emerged as promising cancer treatments, having shown significant antitumor activity against a large variety of human tumors. Objective: Our study aims at determining which parameters define the sensitivity of human melanoma cells to oncolytic MV infection. Method: We analyzed both in vitro and in vivo the oncolytic activity of MV against a panel of human melanoma cell established in our laboratory. We tested whether either type I interferons or the inter-feron pathway inhibitor Ruxolitinib could modulate the sensitivity of these cells to oncolytic MV infection. Results: Human melanoma cells exhibit varying levels of sensitivity to MV infection in culture and as tumor xenografts. As these differences are not explained by their expression level of the CD46 receptor, we hypothesized that antiviral immune responses may be suppressed in certain cell resulting in their inability to control infection efficiently. By analyzing the type I IFN response, we found that resistant cells had a fully functional pathway that was activated upon MV infection. On the contrary, sensitive cell showed defects in this pathway. When pre-treated with IFN-α and IFN-β, all but one of the sensitive cell became resistant to MV. Cells resistant to MV were rendered sensitive to MV with Ruxolitinib. Conclusion: Type I interferon response is the main determinant for the sensitivity or resistance of melanoma to oncolytic MV infection. This will have to be taken into account for future clinical trials on oncolytic MV

New Computerized Color Image Analysis for the Quantification of Interstitial Fibrosis in Renal Transplantation

International audienceBackground. Chronic allograft injury, the primary cause of late allograft failure in renal transplantation, can be diagnosed early at a preclinical stage by histopathological changes such as interstitial fibrosis (IF). Currently, assessed by semiquantitative analysis in the Banff classification, IF quantification is limited by pathologist's subjective interpretation.Methods. We have designed algorithms dedicated to quantify IF by computerized color image analysis. This innovative and objective software automatically extracts the green areas characteristic of IF in Masson's trichrome based on color image segmentation followed by removal of nonspecific IF staining (capsula, sclerosis glomeruli and normal glomeruli, normal basement membrane) and computes an index. It also counts automatically the number of glomeruli. Sixty-seven Masson stained renal transplant biopsies at various IF stages were imaged using a digital color camera mounted on a microscope. We tested the robustness of the method against varying acquisition parameters.Results. We demonstrated that the parameters do not have an impact on this quantification and that the algorithm is able to handle biopsy color variations. The intra- and interobserver reproducibility was good (P<0.003). The kappa coefficient that was performed on another set of 90 biopsies to evaluate the concordance of our method with an expert Banff quantification was 0.68, indicating a substantial agreement. Finally, the computerized IF correlated with renal function.Conclusion. This study demonstrates that computerized color image analysis is a reliable and reproducible method to evaluate renal IF in routine practice and in multi-centric studies

Do kidney histology lesions predict long-term kidney function after liver transplantation?

International audienceHistological renal lesions observed after liver transplantation are complex, multifactorial, and interrelated. The aims of this study were to determine whether kidney lesions observed at five yr after liver transplantation can predict long-term kidney function. Ninety-nine liver transplant patients receiving calcineurin inhibitor (CNI)-based immunosuppression, who had undergone a kidney biopsy at 60 ± 48 months post-transplant, were included in this follow-up study. Kidney biopsies were scored according to the Banff classification. Estimated glomerular filtration rate (eGFR) was assessed at last follow-up, that is, 109 ± 48 months after liver transplantation. eGFR decreased from 92 ± 33 mL/min at transplantation to 63 ± 19 mL/min after six months, to 57 ± 17 mL/min at the kidney biopsy, to 54 ± 24 mL/min at last follow-up (p < 0.0001). At last follow-up, only three patients required renal replacement therapy. After the kidney biopsy, 13 patients were converted from CNIs to mammalian target of rapamycin inhibitors, but no significant improvement in eGFR was observed after conversion. Elevated eGFR at six months post-transplant and a lower fibrous intimal thickening score (cv) observed at five yr post-transplant were the two independent predictive factors for eGFR ≥60 mL/min at nine yr post-transplant. Long-term kidney function seems to be predicted by the kidney vascular lesions