Kinetic studies of polysaccharides and lipids biosynthesis during the cultivation of macromycetes

The physiological behaviour of several edible and medicinal fungi, grown basically in liquid cultures, was investigated. Specifically, the production of mycelial mass, the substrate consumption, the accumulation and (in some cases) the degradation of intracellular compounds like polysaccharides and lipids, as well as the secretion of exopolysaccharides (EPS) was studied, with special attention given in the macromycetous Volvariella volvacea. Intensive literature survey showed relative lack of comparative data on the physiological behaviour and biosynthetic capacity of edible and medicinal fungi in liquid synthetic culture media. Initially, 9 basidiomycetes (Ganoderma lucidum, G. applanatum, Auricularia auricula-judae, Lentinula edodes, Flammulina velutipes, Pleurotus pulmonarius, P. ostreatus, Agrocybe aegerita, V. volvacea) and 2 ascomycetes (Morchella elata, M. esculenta) were evaluated by examining their ability to produce mycelial mass, exopolysaccharides (EPS) and lipids in liquid static- and shake-flask cultures at various culture media based on glucose. High values of dry mycelial mass (~ 13-19 g/l), EPS (~ 1.0-1.3 g/l) and lipids (up to 22.0%, w/w, in dry matter) were reported for several of the studied strains. Fatty acid (FA) analysis of cellular lipids showed high concentrations of linoleic acid for most of the strains studied. By this way, the 6 most interesting species (P. pulmonarius, G. applanatum, F. velutipes, A. aegerita, V. volvacea and M. esculenta) were selected and further kinetic analysis of growth and biosynthesis exo-and endo-polysaccharides (IPS) and lipids was made. Extension of the fermentation time resulted in higher concentrations of biomass, compared with the initial experiment (maximum biomass values ~20-22.5 g/l), whereas the conversion yield of biomass produced per glucose consumed (YX/Glc) was in several cases promising (0.6-0.9 g/g). Additionally, the maximum EPS values showed great variation depending on the strain and the application (or not) of agitation. Also, very high concentrations of IPS (e.g. 5.8-10.9 g/l), close to the maximum reported in the literature, were syntheses. IPS composition in simple sugars varied according to cultivation time and was characterized primarily by glucose and in smaller percentages by fructose, mannitol and xylitol. Relatively high concentrations of lipids (e.g. 20-22.5%, w/w) were recorded in the early growth stages (e.g. up to the 12th day after inoculation), while then degradation was observed. The main cellular FAs were linoleic (>50%, w/w) followed by oleic (up to 40%, w/w) and palmitic (10-30%, w/w). Differences in the FA composition related with the fermentation time and the application (or not) of agitation were revealed, with the profile of FAs being the most saturated in M. esculenta and V. volvacea fungi. In another series of experiments, the fungus V. volvacea was more extensively studied, by evaluating the mycelium growth rate of four V. volvacea strains (188, 190, 191 and 192) grown in Petri dishes and by assessing the production of mycelial mass for the above mentioned strains in liquid cultures. Analysis in the FA composition of fungal lipids demonstrated for all strains a non-negligible presence of low- and high-chain saturated FAs (e.g. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0), suggesting that this FA profile is typical for V. volvacea. Quantification of the fractions of the produced lipids showed for most strains relatively higher content of neutral lipids (NL), with glycolipids and sphingolipids (G+S) and principally phospholipids (PL) found in much smaller amounts. FA analysis of the fractions showed as most saturated fraction that of PL. Strain V. volvacea 190 was then grown in both agitated and static conditions and glucose consumption and biomass, IPS and EPS production were almost identical for both cultures. Only the production of lipids (in %, w/w) showed almost double value in agitated compared with static culture, while FA analysis of fungal lipids confirmed the previous findings. Quantification of lipid fractions at different stages of fungus growth cycle showed that, in the early stages of fermentation where higher amounts of lipids (%, w/w) were detected, the percentage of NL was higher and during lipid degradation process, selective consumption of NL along with an increase in G+S and PL occurred. Moreover, strain V. volvacea 190 was used to evaluate the effect of 10 different sources of carbon and nitrogen in its physiology. With initial sugar concentration of 30 g/l, high biomass production (14.5-15.2 g/l) was achieved with glucose and fructose employed as substrates in both agitated and static cultures and in starch (15.5 g/l) for agitated cultures, while satisfactory amounts of biomass (e.g. 11.3 g/l) accompanied by high yields YX/S (~0.7 g/g) were reported for xylose in static cultures. Much lower biomass production was recorded in the disaccharides maltose and sucrose, in both agitated and static cultures. Concerning nitrogen sources, peptone and yeast extract gave very satisfactory results, while low biomass was observed in urea, NH4NO3 and L-tryptophan. Regarding the production of EPS, the most satisfactory substrates were glucose and fructose in agitated conditions and xylose, starch and fructose in static ones. Interestingly, very satisfactory biosynthesis in EPS was performed in substrates that did not favour at all the production of biomass (e.g. maltose, sucrose). The concentration of IPS was depended on the employed carbon source, with glucose and fructose favouring the production of IPS under agitated and static conditions and starch in shake-flask experiments. Glucose was the main base-unit for the IPS synthesized, regardless of the substrate used. Biosynthesis and FA composition of total microbial lipids studied in various carbon and nitrogen sources used validated the previous results, while larger amounts of lipids (%, w/w) were reported in the early stages of growth (maximum lipid percentage ~18%, w/w) with the percentage of lipids being reduced remarkably with time. FA analysis of cellular lipids showed high content of linoleic acid, in many cases however, non-negligible presence of low-chain and high-chain and saturated FAs (e.g. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0) was reported. The FA composition of V. volvacea AMRL 190 presented differences in relation with the individual sugars used as substrates. Also, quantification of the lipid fractions showed (relatively or remarkably) high content of the NL (47-65%, w/w, of total lipid), while in smaller amounts were detected the fractions of G+S and PL. Compositional analysis of PL showed differences related to the carbon sources used, while the main PL detected were the phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylserine (PS). Finally, the macromycetous V. volvacea 190 was cultivated under increasing initial glucose concentrations (~30 to 95 g/l) and constant initial concentration of nitrogen. In the early stages of fermentation, increasing the initial ratio C/N (from 20 to 60) resulted in a marked increase in the percentage of intracellular lipid produced (from ~14% to ~31%, w/w), whereas the maximum concentration of biomass (maximum biomass value ~ 22 g/l for initial glucose concentration of 95 g/l) was also increased. However, biomass yield YX/Glc significantly decreased with the initial glucose concentration increase, while interestingly, glucose consumption rate (rGlc in g/l/d) significantly increased with the increase of glucose concentration into the medium. The increasing nitrogen restriction of the medium resulted in IPS biosynthesis in large and constantly increasing rates. The maximum IPS concentration was detected for initial glucose concentration 95 g/l and it was 12.2 g/l, a value compared with the highest values reported in the literature. Kinetic analysis of biosynthesis of intracellular lipids and polysaccharides showed a succession in the accumulation of the intracellular products, as initially relatively high concentrations of lipids were synthesized and then the progressive nitrogen limiting conditions led to increased accumulation of IPS with simultaneous degradation of intracellular lipids. In substrates with high C/N ratios, there was a high biosynthetic potential for production of fungal lipids rich in linoleic acid, while the presence of low- and high-chain saturated FAs (e.g. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0) were greatly reduced. In line with previous findings, the PL fraction was the most saturated, whereas the main PL detected were PE, PI, PC and PS, the percentage of which changed with the C/N ratio and the time of fermentation. Finally, the composition in simple sugars of the produced IPS changed depended on the cultivation time, with glucose being the primary building block of intracellular polysaccharides.Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής διερευνήθηκαν οι φυσιολογικές παράμετροι της μικροβιακής αύξησης και μελετήθηκαν η παραγωγή μυκηλιακής μάζας, η κατανάλωση σακχάρων, η συσσώρευση και (σε κάποιες περιπτώσεις) η αποικοδόμηση ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών (IPS) και λιπιδίων και η έκκριση εξωπολυσακχαριτών (EPS) σε στελέχη εδώδιμων και φαρμακευτικών μακρομυκήτων καλλιεργούμενων κυρίως σε υγρές ζυμώσεις, με την έμφαση να δίνεται στις μελέτες για το μύκητα Volvariella volvacea. Ενδελεχής διερεύνηση της βιβλιογραφίας έδειξε σχετική έλλειψη συγκριτικών δεδομένων όσον αφορά στην φυσιολογική συμπεριφορά και τη βιοσυνθετική ικανότητα εδώδιμων και φαρμακευτικών μακρομυκήτων σε συνθετικά υγρά θρεπτικά μέσα. Σε ένα πρώτο επίπεδο, αξιολογήθηκαν 9 βασιδιομύκητες: Ganoderma lucidum, G. applanatum, Auricularia auricula-judae, Lentinula edodes, Flammulina velutipes, Pleurotus pulmonarius, P. ostreatus, Agrocybe aegerita, V. volvacea και 2 ασκομύκητες: Morchella elata, M. esculenta και μελετήθηκε συγκριτικά η ικανότητά τους για παραγωγή μυκηλιακής μάζας, EPS και λιπιδίων σε υγρές αναδευόμενες και μη-αναδευόμενες καλλιέργειες, σε διάφορα θρεπτικά μέσα με βάση τη γλυκόζη. Υψηλές τιμές ξηράς μυκηλιακής μάζας (~14-19 g/l), EPS (~1,0-1,3 g/l) και λιπιδίων (έως 22,0%, κ.β. επί ξηράς μάζας) αναφέρθηκαν για αρκετά από τα υπό μελέτη στελέχη. Η ανάλυση σε λιπαρά οξέα των κυτταρικών λιπιδίων των μακρομυκήτων έδειξε υψηλές συγκεντρώσεις του λινελαϊκού οξέος για τα περισσότερα από τα στελέχη που μελετήθηκαν. Έτσι, επιλέχθηκαν τα 6 πιο ενδιαφέροντα είδη (P. pulmonarius, G. applanatum, F. velutipes, A. aegerita, V. volvacea και M. esculenta) στα οποία πραγματοποιήθηκε ενδελεχής μελέτη της αύξησης και βιοσύνθεσης εξω- και ενδο-πολυσακχαριτών (IPS) και λιπιδίων. Επέκταση του χρόνου της ζύμωσης είχε ως αποτέλεσμα να επιτευχθούν υψηλότερες συγκεντρώσεις βιομάζας σε σχέση με το αρχικό πείραμα (μέγιστες τιμές μέχρι ~20-22,5 g/l), ενώ και ο συντελεστής απόδοσης της παραγόμενης βιομάζας προς την αναλωθείσα γλυκόζη (YX/Glc) ήταν σε αρκετές περιπτώσεις πολύ υψηλός (0,6-0,9 g/g). Επιπλέον, καταγραφή των μέγιστων τιμών των παραγόμενων EPS έδειξε μεγάλη διακύμανση ανάλογα το στέλεχος και την εφαρμογή ή όχι ανάδευσης. Ακόμα, παράχθηκαν σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις IPS (π.χ. 5,8-10,9 g/l), η σύσταση των οποίων σε απλά σάκχαρα μεταβαλλόταν σε συνάρτηση με το χρόνο της ζύμωσης και χαρακτηριζόταν κατά κύριο λόγο από γλυκόζη και σε μικρότερα ποσοστά από φρουκτόζη, μαννιτόλη και ξυλιτόλη. Σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις λιπιδίων (σε % κ.β. επί ξηράς μυκηλιακής μάζας) καταγράφηκαν στα πρώιμα στάδια του αυξητικού κύκλου (μέχρι τη 12η ημέρα καλλιέργειας), φτάνοντας το 20,0-22,5%, κ.β. ενώ στη συνέχεια παρατηρήθηκε αποικοδόμησή τους. Η σύσταση των λιπιδίων, με κύριο λιπαρό οξύ το λινελαϊκό (ποσοστό >50%, κ.β.) και ακόλουθα τα ελαϊκό (έως 40%, κ.β.) και παλμιτικό (10-30%, κ.β.), εμφάνισε διαφοροποιήσεις σε σχέση με το χρόνο ζύμωσης και την εφαρμογή ή όχι ανάδευσης, με το προφίλ των λιπαρών οξέων να σημειώνεται πιο κορεσμένο στους M. esculenta και V. volvacea. Σε άλλη σειρά πειραμάτων, μελετήθηκε εκτενέστερα η φυσιολογία του μύκητα V. volvacea, με συγκριτική αξιολόγηση της ταχύτητας αύξησης του μυκηλίου τεσσάρων στελεχών του είδους (188, 190, 191 και 192) που καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία Petri και σε υγρές ζυμώσεις, προκειμένου να αξιολογηθεί η παραγωγή μυκηλιακής μάζας για τα τέσσερα στελέχη. Ανάλυση του κυτταρικού λίπους σε λιπαρά οξέα για όλα τα στελέχη έδειξε μη-αμελητέα ύπαρξη χαμηλομοριακών και υψηλομοριακών κορεσμένων λιπαρών οξέων (π.χ. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0), υποδεικνύοντας ότι αυτού του είδους το προφίλ λιπαρών οξέων είναι χαρακτηριστικό για το είδος V. volvacea. Ποσοτικοποίηση των κλασμάτων των παραγόμενων λιπιδίων έδειξε σχετικά υψηλότερη περιεκτικότητα του ουδέτερου κλάσματος (NL) από ό,τι το κλάσμα των γλυκολιπιδίων και σφιγκολιπιδίων (G+S), ενώ σε πολύ μικρότερα ποσά ανιχνεύτηκαν τα φωσφολιπίδια (PL). Ανάλυση των κλασμάτων σε λιπαρά οξέα έδειξε ως πιο κορεσμένο κλάσμα αυτό των φωσφολιπιδίων. Στη συνέχεια, το στέλεχος 190 καλλιεργήθηκε σε αναδευόμενες και στατικές συνθήκες και τόσο η κατανάλωση της γλυκόζης, όσο και η παραγωγή βιομάζας, IPS και EPS ήταν σχεδόν ταυτόσημες για αμφότερες τις καλλιέργειες. Μόνο η παραγωγή λιπιδίων (σε % κ.β. επί ξηράς μάζας) εμφάνισε σχεδόν διπλάσιες τιμές στην αναδευόμενη σε σχέση με τη στατική καλλιέργεια, ενώ η ανάλυση των λιπιδίων σε λιπαρά οξέα επιβεβαίωσε τα προηγούμενα ευρήματα. Ποσοτικός προσδιορισμός των κλασμάτων στις διάφορες φάσεις του αυξητικού κύκλου έδειξε ότι στα πρώιμα στάδια της ζύμωσης όπου ανιχνεύτηκαν υψηλότερες ποσότητες λιπιδίων επί ξηράς μάζας, το ποσοστό του NL ήταν υψηλότερο και ενόσω καταναλώνονταν τα ενδοκυτταρικά λιπίδια, υπήρξε εκλεκτική κατανάλωση των NL με ταυτόχρονη αύξηση του ποσοστού των G+S και των PL. Επιπλέον, το στέλεχος V. volvacea 190 χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της επίδρασης διαφορετικών πηγών C και Ν στη φυσιολογία του. Μεγάλη παραγωγή βιομάζας διαπιστώθηκε κατά την αύξησή του στη γλυκόζη και τη φρουκτόζη (14,5-15,2 g/l), τόσο σε αναδευόμενες όσο και σε στατικές καλλιέργειες, αλλά και στο άμυλο στις αναδευόμενες (15,5 g/l), ενώ ικανοποιητικές ποσότητες βιομάζας (π.χ. 11,3 g/l) και με υψηλό συντελεστή YX/Glc (~0,7 g/g) αναφέρθηκαν για την ξυλόζη στις στατικές καλλιέργειες. Πολύ μικρότερη παραγωγή βιομάζας σημειώθηκε στις μαλτόζη και σακχαρόζη, τόσο στις αναδευόμενες όσο και τις στατικές καλλιέργειες. Σχετικά με τις πηγές αζώτου, η πεπτόνη και το εκχύλισμα ζύμης έδωσαν πολύ ικανοποιητικά αποτελέσματα, ενώ περιορισμένη βιομάζα παρατηρήθηκε στην ουρία, το ΝΗ4ΝΟ3 και την L-τρυπτοφάνη. Σε ό,τι αφορά την παραγωγή των EPS, τα πιο ικανοποιητικά υποστρώματα ήταν οι γλυκόζη και φρουκτόζη υπό αναδευόμενες συνθήκες και οι ξυλόζη, άμυλο και φρουκτόζη υπό στατικές. Θα πρέπει να σημειωθεί ωστόσο ότι πολύ ικανοποιητική βιοσύνθεση EPS πραγματοποιήθηκε στα υποστρώματα που δεν ευνόησαν την παραγωγή βιομάζας. Η συγκέντρωση των IPS έδειξε να εξαρτάται από την πηγή C, με τις γλυκόζη και φρουκτόζη να ευνοούν την παραγωγή τους υπό αναδευόμενες και στατικές συνθήκες και το άμυλο υπό αναδευόμενες. Κύριο συστατικό των παραγόμενων πολυσακχαριτών αναδείχθηκε η γλυκόζη, ανεξάρτητα από το υπόστρωμα που χρησιμοποιήθηκε. H βιοσύνθεση και η σύσταση των συνολικών λιπιδίων που μελετήθηκαν στις διάφορες πηγές άνθρακα και αζώτου και σε διάφορα χρονικά σημεία της ζύμωσης ήταν σε συνάφεια με τα προηγούμενα αποτελέσματα, καθώς μεγαλύτερα ποσοστά λιπιδίων (σε %, κ.β. επί της ξηράς μυκηλιακής μάζας) αναφέρθηκαν στις πρώιμες φάσεις της αύξησης (μέγιστο ποσοστό λιπιδίων ~18%, κ.β.), με το ποσοστό λίπους να μειώνεται αξιοσημείωτα προϊούσης της ζύμωσης. Όπως και σε προηγούμενες αναλύσεις, παρατηρήθηκε μη-αμελητέα ύπαρξη χαμηλομοριακών και υψηλομοριακών κορεσμένων λιπαρών οξέων (π.χ. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0) επί των παραγόμενων μυκηλιακών λιπιδίων. Πάντως, καίτοι οι διάφορες πηγές άνθρακα που χρησιμοποιήθηκαν παρουσιάζουν μεγάλη βιοχημική ομοιότητα σε μεταβολικό επίπεδο, η αύξηση του V. volvacea AMRL 190 σε αυτού του είδους τα υποστρώματα έδειξε αξιοσημείωτες διαφοροποιήσεις στο επίπεδο της σύστασης σε λιπαρά οξέα των συνολικών λιπιδίων. Επίσης, ποσοτικοποίηση των λιπιδιακών κλασμάτων έδειξε (σχετικά) υψηλή περιεκτικότητα των NL (47-65% κ.β. επί των συνολικών λιπιδίων), ενώ σε μικρότερα ποσά ανιχνεύτηκαν τα G+S και (κυρίως) τα PL. Ανάλυση της σύστασης των φωσφολιπιδίων έδειξε διαφοροποιήσεις σχετιζόμενες με τις πηγές άνθρακα που χρησιμοποιήθηκαν, ενώ τα κύρια PL που ανιχνεύτηκαν ήταν οι κλάσεις φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (PE), φωσφατιδυλινοσιτόλη (PI), φωσφατιδυλοχολίνη (PC) και φωσφατιδυλοχολίνη (PS). Τέλος, ο μύκητας V. volvacea 190 καλλιεργήθηκε υπό αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις γλυκόζης (30 έως 95 g/l) και σταθερή αρχική συγκέντρωση αζώτου. Στα πρώιμα στάδια των ζυμώσεων, η αύξηση του αρχικού λόγου C/N (από 20 έως 60) είχε ως απόρροια αξιοσημείωτη αύξηση του ποσοστού των παραγόμενων ενδοκυτταρικών λιπιδίων (από ~14% σε ~31% κ.β. επί ξηράς μάζας), ενώ αυξήθηκε και η μέγιστη συγκέντρωση μυκηλιακής μάζας (μέγιστη τιμή βιομάζας ~22 g/l για αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 95 g/l). Παρόλα αυτά, ο συντελεστής YX/Glc μειώθηκε αξιοσημείωτα με την αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης γλυκόζης, ενώ η ταχύτητα κατανάλωσης της γλυκόζης rGlc (σε g/l/d) αυξήθηκε σημαντικά. Ο αυξανόμενος περιορισμός του μέσου σε άζωτο είχε ως αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση IPS σε πολύ μεγάλες και διαρκώς αυξανόμενες ποσότητες. Η μέγιστη συγκέντρωση IPS ανιχνεύτηκε για αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 95 g/l και ήταν 12,2 g/l, τιμή συγκρινόμενη με τις υψηλότερες της διεθνούς βιβλιογραφίας. Κινητική ανάλυση της βιοσύνθεσης ενδοκυτταρικών λιπιδίων και πολυσακχαριτών έδειξε μια αλληλοδιαδοχή στη συσσώρευση των ενδοκυτταρικών προϊόντων, καθώς αρχικά συντέθηκαν σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις λιπίδια και κατόπιν παρατηρήθηκε αύξηση της συσσώρευσης των IPS με ταυτόχρονη αποικοδόμηση των λιπιδίων. Στα υποστρώματα που εμφάνιζαν υψηλούς λόγους C/N υπήρχε σύνθεση λιπιδίων πλούσιων σε λινελαϊκό οξύ, ενώ η παρουσία των χαμηλομοριακών και υψηλομοριακών κορεσμένων λιπαρών οξέων (π.χ. C8:0, C10:0, C12:0, C20:0) μειωνόταν πολύ. Το κλάσμα των PL ήταν εκ νέου το πιο κορεσμένο, ενώ ανιχνεύτηκαν κυρίως οι κλάσεις PE, PI, PC και PS, το ποσοστό των οποίων μεταβάλλονταν με το λόγο C/N και το χρόνο της ζύμωσης. Τέλος, η σύσταση των παραγομένων IPS σε απλά σάκχαρα μεταβαλλόταν σε συνάρτηση με το χρόνο καλλιέργειας, με τη γλυκόζη να είναι η κύρια δομική μονάδα των ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών

Carposome productivity of Pleurotus ostreatus and Pleurotus eryngii growing on agro-industrial residues enriched with nitrogen, calcium salts and oils

The suitability of the abundant agro-industrial residues wheat straw (WS; control), barley and oats straw (BOS) and rice husk (RH), supplemented with various sources of oils (sunflower, corn oil), nitrogen (peptone, yeast extract) and calcium salts (CaSO4·2H2O, CaCl2), as novel substrates in solid-state fermentation of selected Pleurotus ostreatus and P. eryngii mushrooms was investigated. The possible effect of different additives on mycelial growth rate, biomass production and endoglucanase, laccase and lipase biosynthesis were evaluated. Moreover, their impact on essential cultivation aspects (earliness, total mushroom yield, biological efficiency) and carposome quality parameters (weight, morphological characteristics) was assessed. Both fungi showed their highest growth rates on BOS substrates and the most positive implementation was CaSO4·2H2O 6 % w/w (Kr = 9.58 mm/ day; P. ostreatus, Kr = 9.42 mm/ day; P. eryngii), while different additives led to enhancement of biomass production. Pleurotus species demonstrated minimal levels of endoglucanase activity, with values ranging from 0.01 to 0.42 U/g of dry weight, regardless of the substrate and the stage of colonization. On the contrary, the maximum values of laccase activity were observed at 50 % of colonization on BOS and RH, while supplementation with nitrogen and calcium sources positively affected its biosynthesis. P. ostreatus and P. eryngii cultivated on BOS supplemented with peptone at 2 and 5 % w/w, synthesized significant laccase amounts, i.e., 12,165.78 and 8,624.55 U/g d.w., respectively. Satisfactory amounts of lipase were produced, especially in substrates supplemented with sunflower 2 % w/w, in quantities up to 1.42 U/g d.w., whereas the highest lipase activity was achieved by P. eryngii on WS supplemented with corn oil at 2 % w/w, with a value of 4.25 U/g d.w. being recorded. Regarding fermentation of Pleurotus species in polypropylene bags, WS and BOS supported faster colonization and shorter earliness period than RH substrates, whereas supplementation did not seem to affect these culture parameters. Furthermore, oils supplementation had a positive effect on BE of both species, with values up to 100 % for P. ostreatus and 80 % for P. eryngii on WS and BOS, whereas on RH the lowest BE values were detected. Morphological characteristics were not significantly affected by the additives. Results indicate the positive impact that certain additives have on mushroom productivity and production of enzymes with great financial and environmental importance

Non-alcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: Clinical challenges of an intriguing link

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) has emerged as the most common liver disorder worldwide mainly attributed to the epidemic spread of obesity and type 2 diabetes mellitus. Although it is considered a benign disease, NAFLD can progress to non-alcoholic steatohepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Most data regarding the epidemiology of NAFLD-related HCC are derived from cohort and population studies and show that its incidence is increasing as well as it is likely to emerge as the leading indication for liver transplantation, especially in the Western World. Although cirrhosis constitutes the main risk factor for HCC development, in patients with NAFLD, HCC can arise in the absence of cirrhosis, indicating specific carcinogenic molecular pathways. Since NAFLD as an underlying liver disease for HCC is often underdiagnosed due to lack of sufficient surveillance in this population, NAFLD-HCC patients are at advanced HCC stage at the time of diagnosis making the management of those patients clinically challenging and affecting their prognostic outcomes. In this current review, we summarize the latest literature on the epidemiology, other than liver cirrhosis-pathogenesis, risk factors and prognosis of NAFLD-HCC patients. Finally, we emphasize the prevention of the development of NAFLD-associated HCC and we provide some insight into the open questions and issues regarding the appropriate surveillance policies for those patients

Valorization of Agro-Industrial Wastes and Residues through the Production of Bioactive Compounds by Macrofungi in Liquid State Cultures: Growing Circular Economy

Vast quantities of side streams produced worldwide by the agricultural and food industry present an environmental challenge and an opportunity for waste upcycling in the frame of the circular bioeconomy. Fungi are capable of transforming lignocellulosic residues and wastes into a variety of added-value compounds with applications in functional food products, pharmaceuticals, chemicals, enzymes, proteins, and the emerging sector of nutraceuticals. The liquid state culture of fungi is an efficient and potentially scalable and reproducible biotechnological tool that allows the optimized production of fungal metabolites. Particularly, the utilization of agro-industrial by-products, residues, and wastes as a substrate for the liquid culture of macrofungi is suggested as an attainable solution in the management of these streams, contributing to climate change mitigation. This review presents recently published literature in the field of liquid state cultures of macrofungi using agro-industrial side streams, the different substrates, methods, and factors affecting their growth and metabolite production, as well as their applications, focusing on the variety of natural valuable compounds produced

Biochemical Evaluation of Agaricus and Pleurotus Strains in Batch Cultures for Production Optimization of Valuable Metabolites

The production of various biochemical compounds such as proteins, glucans and glucanases, from the mycelium of four strains of Basidiomycetes species, Agaricus bisporus, Agaricus subrufescens, Pleurotus eryngii and Pleurotus ostreatus, during batch culture in shaking flasks, was studied. Fungi were cultured for 26 days in defined media with glucose as carbon source and were primarily evaluated for their ability to consume glucose and produce mycelial mass and intracellular polysaccharides (IPS). Results showed that on the 26th day of cultivation, P. ostreatus produced the maximum biomass (16.75 g/L), whereas P. eryngii showed the maximum IPS concentration (3.82 g/L). All strains presented a similar pattern in total protein production, with A. bisporus having the highest percentage of total proteins (36%, w/w). The calculated correlation coefficients among ribonucleic acid (RNA) vs. biomass (0.97) and RNA vs. protein (0.97) indicated a very strong relation between RNA and biomass/protein synthesis. The studied strains exhibited an increase in total glucan and glucanase (β-1,6) production during cultivation, with A. bisporus reaching the highest glucan percentage (8%, w/w) and glucanase activity (12.7 units/g biomass). Subsequently, processed analytical data were used in contour-graph analysis for data extrapolation to optimize future continuous culture

Upgrading Grape Pomace through Pleurotus spp. Cultivation for the Production of Enzymes and Fruiting Bodies

Grape pomace, a by-product derived from winery industries, was used as fermentation media for the production of added-value products through the cultivation of two Pleurotus species. Solid-state (SSF), semiliquid (SLF), and submerged (SmF) fermentations were carried out using grape pomace as substrate. The effect of the different fermentations on the consumption of phenolic compounds, the production of mycelial mass and enzymes was evaluated using P. ostreatus and P. pulmonarius. The production of fungal biomass and enzymes was influenced by the fermentation mode. The maximum biomass values of ~0.5 g/g were obtained for both P. pulmonarius and P. ostreatus in SmF. Laccase production was induced in SSF and a maximum activity of 26.247 U/g was determined for P. ostreatus, whereas the highest endoglucanase activity (0.93 U/g) was obtained in the SmF of the same fungi. Analysis of phenolic compounds showed that both strains were able to degrade up to 79% of total phenolic content, regardless the culture conditions. Grape pomace was also evaluated as substrate for mushroom production. P. pulmonarius recorded the highest yield and biological efficiency of 14.4% and 31.4%, respectively. This study showed that mushroom cultivation could upgrade winery by-products towards the production of valuable food products

Growth Potential of Selected Yeast Strains Cultivated on Xylose-Based Media Mimicking Lignocellulosic Wastewater Streams: High Production of Microbial Lipids by Rhodosporidium toruloides

The potential of Rhodosporidium toruloides, Candida oleophila, Metschnikowia pulcherima, and Cryptococcus curvatus species to produce single-cell-oil (SCO) and other valuable metabolites on low-cost media, based on commercial-type xylose, was investigated. Rhodosporidium strains were further evaluated in shake-flasks using different lignosulphonate (LS) concentrations, in media mimicking waste streams derived from the paper and pulp industry. Increasing the LS concentration up to 40 g/L resulted in enhanced dry cell weight (DCW) while SCO production increased up to ~5.0 g/L when R. toruloides NRRL Y-27012 and DSM 4444 were employed. The intra-cellular polysaccharide production ranged from 0.9 to 2.3 g/L in all fermentations. Subsequent fed-batch bioreactor experiments with R. toruloides NRRL Y-27012 using 20 g/L of LS and xylose, led to SCO production of 17.0 g/L with maximum lipids in DCW (YL/X) = 57.0% w/w. The fatty acid (FA) profile in cellular lipids showed that oleic (50.3–63.4% w/w) and palmitic acid (23.9–31.0%) were the major FAs. Only SCO from batch trials of R. toruloides strains contained α-linolenic acid. Media that was supplemented with various LS concentrations enhanced the unsaturation profile of SCO from R. toruloides NRRL Y-27012. SCO from R. toruloides strains could replace plant-based commodity oils in oleochemical-operations and/or it could be micro- and nano-encapsulated into novel food-based formulas offering healthier food-products

Spent Mushroom Substrate Hydrolysis and Utilization as Potential Alternative Feedstock for Anaerobic Co-Digestion

Valorization of lignocellulosic biomass, such as Spent Mushroom Substrate (SMS), as an alternative substrate for biogas production could meet the increasing demand for energy. In view of this, the present study aimed at the biotechnological valorization of SMS for biogas production. In the first part of the study, two SMS chemical pretreatment processes were investigated and subsequently combined with thermal treatment of the mentioned waste streams. The acidic chemical hydrolysate derived from the hydrothermal treatment, which yielded in the highest concentration of free sugars (≈36 g/100 g dry SMS, hydrolysis yield ≈75% w/w of holocellulose), was used as a potential feedstock for biomethane production in a laboratory bench-scale improvised digester, and 52 L biogas/kg of volatile solids (VS) containing 65% methane were produced in a 15-day trial of anaerobic digestion. As regards the alkaline hydrolysate, it was like a pulp due to the lignocellulosic matrix disruption, without releasing additional sugars, and the biogas production was delayed for several days. The biogas yield value was 37 L/kg VS, and the methane content was 62%. Based on these results, it can be concluded that SMS can be valorized as an alternative medium employed for anaerobic digestion when pretreated with both chemical and hydrothermal hydrolysis