Autocatalytic maturation of the Tat-dependent halophilic subtilase Nep produced by the archaeon Natrialba magadii

Halolysins are subtilisin-like extracellular proteases produced by haloarchaea that possess unique protein domains and are salt dependent for structural integrity and functionality. In contrast to bacterial subtilases, thematurationmechanismof halolysins has not been addressed. The halolysin Nep is secreted by the alkaliphilic haloarchaeon Natrialba magadii, and the recombinant active enzyme has been synthesized in Haloferax volcanii. Nep contains an N-terminal signal peptide with the typical Tat consensus motif (GRRSVL), an N-terminal propeptide, the protease domain, and a C-terminal domain. In this study, we used Nep as amodel protease to examine the secretion andmaturation of halolysins by using genetic and biochemical approaches.Mutant variants of Nep were constructed by site-directedmutagenesis and expressed in H. volcanii, which were then analyzed by protease activity andWestern blotting. The Tat dependence of Nep secretion was demonstrated in Nep RR/KK variants containing double lysine (KK) in place of the twin arginines (RR), in which Nep remained cell associated and the extracellular activity was undetectable. High-molecular-mass Nep polypeptides without protease activity were detected as cell associated and extracellularly in the Nep S/A variant, in which the catalytic serine 352 had been changed by alanine, indicating that Nep protease activity was needed for precursor processing and activation. Nep NSN 1-2 containing amodification in two potential cleavage sites for signal peptidase I (ASA) was not efficiently processed and activated. This study examined for the first time the secretion and maturation of a Tat-dependent halophilic subtilase.Fil: Ruiz, Diego M,. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Paggi, Roberto Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Gimenez, Maria Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: de Castro, Rosana Esther. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentin

A rhomboid protease gene deletion affects a novel oligosaccharide N-linked to the S-layer glycoprotein of Haloferax volcanii

Rhomboid proteases occur in all domains of life; however, their physiological role is not completely understood, and nothing is known of the biology of these enzymes in Archaea. One of the two rhomboid homologs of Haloferax volcanii (RhoII) is fused to a zinc finger domain. Chromosomal deletion of rhoII was successful, indicating that this gene is not essential for this organism; however, the mutant strain (MIG1) showed reduced motility and increased sensitivity to novobiocin. Membrane preparations of MIG1 were enriched in two glycoproteins, identified as the S-layer glycoprotein and an ABC transporter component. The H. volcanii S-layer glycoprotein has been extensively used as a model to study haloarchaeal protein N-glycosylation. HPLC analysis of oligosaccharides released from the S-layer glycoprotein after PNGase treatment revealed that MIG1 was enriched in species with lower retention times than those derived from the parent strain. Mass spectrometry analysis showed that the wild type glycoprotein released a novel oligosaccharide species corresponding to GlcNAc-GlcNAc(Hex)2-(SQ-Hex)6 in contrast to the mutant protein, which contained the shorter form GlcNAc2(Hex)2-SQ-Hex-SQ. A glycoproteomics approach of the wild type glycopeptide fraction revealed Asn-732 peptide fragments linked to the sulfoquinovose-containing oligosaccharide. This work describes a novel N-linked oligosaccharide containing a repeating SQ-Hex unit bound to Asn-732 of the H. volcanii S-layer glycoprotein, a position that had not been reported as glycosylated. Furthermore, this study provides the first insight on the biological role of rhomboid proteases in Archaea, suggesting a link between protein glycosylation and this protease family.Fil: Parente, Juliana Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Orgánica; ArgentinaFil: Casabuono, Adriana Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Orgánica; ArgentinaFil: Ferrari, María Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Paggi, Roberto Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: de Castro, Rosana Esther. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Couto, Alicia Susana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Orgánica; ArgentinaFil: Gimenez, Maria Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentin

Halófilos en acción

Los organismos extremófilos se desarrollan en ambientes con condiciones adversas para la mayoría de los seres vivos, tales como temperaturas por debajo de 0 o por encima de los 80 ºC, pHs muy ácidos o básicos y alta salinidad. Los organismos halófilos son capaces de vivir en altas concentraciones de sal e incluyen algunas plantas, crustáceos, bacterias y mayoritariamente arqueas. Nuestro grupo de Investigación se ha centrado en el estudio de microorganismos halófilos obligados desde el punto de vista básico de su fisiología como así también en la exploración de sus posibles aplicaciones biotecnológicas.Nuestras líneas de investigación incluyen estudios sobre:1- La degradación y procesamiento de proteínas a nivel de la membrana celular en la haloarquea modelo Haloferax volcanii. En particular estudiamos las proteasas Lon y romboides con el fin de conocer su rol biológico, blancos de acción y su participación en la supervivencia en condiciones extremas. Estas enzimas existen en la mayoría de los organismos y han sido relacionadas con procesos de patogénesis de bacterias y hongos, así como con enfermedades humanas como la diabetes, mal de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y cáncer. El estudio de estas proteasas en un modelo no patógeno y sencillo puede aportar conocimientos fundamentales sobre el proceso de proteólisis celular incluyendo informaciónrelevante en el área biomédica (desarrollo de estrategias terapéuticas).2- La diversidad de microorganismos con respiración anaerobia y sus diferentes aceptores de electrones, a fin de conocer las estrategias fisiológicas de adaptación a estos ambientes con escasa disponibilidad de oxígeno.3- Los sistemas de quimiosensado de bacterias halófilas, incluyendo una cepa aislada de agua del puerto de Mar del Plata, Halomonas titanicae KHS3. Esta cepa es capaz de utilizar fenantreno como única fuente de carbono y responde quimiotácticamente a compuestos aromáticos. Además, H. titanicae KHS3 sintetiza polihidroxialcanoatos, la materia prima para la fabricación de bioplásticos, a partir de diversas fuentes de carbono (incluido el fenantreno).4- La producción, extracción y caracterización de biomateriales de interés biotecnológico a partir de microorganismos halófilos. Hemos generado cepas de haloarqueas ?sobreproductoras? de pigmentos carotenoides, los cuales presentan propiedades bioactivas con aplicación en las industrias farmacéutica, cosmética y alimenticia. También estudiamos la síntesis biológica de nanopartículas metálicas que presentan actividad antimicrobiana y aplicaciones en diversos campos como el biomédico y el electrónico; y de compuestos surfactantes que podrían ser de utilidad en la industria del petróleo y en estrategias de remediación ambiental.Financiación UNMdP, ANPCyT.Fil: Costa, Mariana Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Cerletti, Micaela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Ferrari, María Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Gimenez, Maria Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Herrera Seitz, Karina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Nercessian, Debora. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Paggi, Roberto Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Pegoraro, César Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Rabino, A.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Redersdorff, Ingrid Emelin. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Solchaga, Juan Ignacio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Urquiza, Delia Natalia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: de Castro, Rosana Esther. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaJornadas de Investigación de la Universidad Nacional de Mar del PlataMar del PlataArgentinaUniversidad Nacional de Mar del Plat

Growth phase-dependent biosynthesis of Nep, a halolysinlike protease secreted by the alkaliphilic haloarchaeon Natrialba magadii

Aims: The alkaliphilic haloarchaeon Natrialba magadii secretes a halolysin-like protease (Nep) that is active and stable in high salt and in organic solvents, which represents a potential resource for biocatalysis in low water activity conditions. In this study, the effect of the growth stage on Nep biosynthesis was examined. Methods and Results: Nep mRNA and extracellular protease activity were measured by RT-PCR and azocaseinolytic activity determination, respectively. Increased abundance in Nep mRNA was observed in Nab. magadii cells with culture age, which correlated with accumulation of extracellular protease activity. Moreover, a ‘stationary phase behavior’ on synthesis of Nep was evidenced in low-density cultures incubated with stationary phase medium. Conclusions: nep gene expression is up-regulated during the transition to the stationary phase in response to "factors" (metabolite and ⁄ or regulatory molecule) occurring in high-density cultures of Nab. magadii. Although the identity of these molecules remains to be determined, preliminary evidence suggests that they are hydrophobic and stable in high salt and high pH values (3Æ5 mol l)1 NaCl, pH 10). Significance and impact of study: This study contributes to gain insight into the regulation of haloarchaeal protease biosynthesis, facilitating the large-scale production of this extremozyme for basic studies or potential applications.Fil: Paggi, Roberto Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Madrid, Enrique Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: D'alessandro, Celeste Paola. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: de Castro, Rosana Esther. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentin

The Lon protease from the haloalkaliphilic archaeon Natrialba magadii is transcriptionally linked to a cluster of putative membrane proteases and displays DNA-binding activity

The ATP-dependent Lon protease is universally distributed in bacteria, eukaryotic organelles and archaea. In comparison with bacterial and eukaryal Lon proteases, the biology of the archaeal Lon has been studied to a limited extent. In this study, the gene encoding the Lon protease of the alkaliphilic haloarchaeon Natrialba magadii (Nmlon) was cloned and sequenced, and the genetic organization of Nmlon was examined at the transcriptional level. Nmlon encodes a 84 kDa polypeptide with a pI of 4.42 which contains the ATPase, protease and membrane targeting domains of the archaeal-type LonB proteases. Nmlon is part of an operon that encodes membrane proteases and it is transcribed as a polycistronic mRNA in N. magadii cells at different growth stages. Accordingly, NmLon was detected in cell membranes of N. magadii throughout growth by Western blot analysis using specific anti-NmLon antibodies. Interestingly, in electrophoretic mobility shift assays, purified NmLon bound double stranded as well as single stranded DNA in the presence of elevated salt concentrations. This finding shows that DNA-binding is conserved in the LonA and LonB subfamilies and suggests that Lon–DNA interaction may be relevant for its function in haloarchaea.Fil: Sastre, Diego Emiliano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; ArgentinaFil: Paggi, Roberto Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; ArgentinaFil: de Castro, Rosana Esther. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; Argentin

Proteome Turnover Analysis in Haloferax volcanii by a Heavy Isotope Multilabeling Approach

The cellular protein repertoire is highly dynamic and responsive to internal or external stimuli. Its changes are largely the consequence of the combination of protein synthesis and degradation, referred collectively as protein turnover. Different proteomics techniques have been developed to determine the whole proteome turnover of a cell, but very few have been applied to archaea. In this chapter we describe a heavy isotope multilabeling method that allowed the successful analysis of relative protein synthesis and degradation rates on the proteome scale of the halophilic archaeon Haloferax volcanii. This method combines N and C isotope metabolic labeling with high-resolution mass spectrometry and data analysis tools (QuPE web-based platform) and could be applied to different archaea.Fil: Paggi, Roberto Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Albaum, Stefan P.. Universitat Bielefeld; AlemaniaFil: Poetsch, Ansgar. Ruhr University Bochum; AlemaniaFil: Cerletti, Micaela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentin

A simple technique to improve the resolution of membrane acidic proteins of the haloarchaeon Haloferax volcanii by 2D electrophoresis

Proteins present in the archaeal cell envelope play key roles in a variety of processes necessary for survival in extreme environments. The haloarchaeon Haloferax volcanii is a good model for membrane proteomic studies because its genome sequence is known, it can be genetically manipulated, and a number of studies at the “omics” level have been performed in this organism. This work reports an easy strategy to improve the resolution of acidic membrane proteins from H. volcanii by 2DE. The method is based on the solubilization, delipidation, and salt removal from membrane proteins. Due to the abundance of the S-layer glycoprotein (SLG) in membrane protein extracts, other proteins from the envelope are consequently underrepresented. Thus, a protocol to reduce the amount of the SLG by EDTA treatment was applied and 11 cm narrow range pH (3.9–5.1) IPG strips were used to fractionate the remaining proteins. Using this method, horizontal streaking was substantially decreased and at least 75 defined spots (20% of the predicted membrane proteome within this pI/Mw range) were reproducibly detected. Two of these spots were identified as thermosome subunit 1 and NADH dehydrogenase from H. volcanii, confirming that proteins from the membrane fraction were enriched. Removal of the SLG from membrane protein extracts can be applied to increase protein load for 2DE as well as for other proteomic methods.Fil: Paggi, Roberto Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; ArgentinaFil: Gimenez, Maria Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; ArgentinaFil: de Castro, Rosana Esther. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; ArgentinaFil: Cesari, Andreina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata; Argentin

Glucose homeostasis in the euryhaline crab Cytograpsus angulatus : Effects of the salinity in the amylase, maltase and sucrase activities in the hepatopancreas and in the carbohydrate reserves in different tissues

We studied the existence, biochemical characteristics and response to different environmental salinities of amylase, maltase and sucrase activity in the intertidal euryhaline crab Cyrtograpsus angulatus (Dana, 1852) along with the response to distinct salinities of glycogen and free glucose content in storage organs. Amylase, maltase and sucrase activities were kept over a broad range of pH and temperature and exhibited Michaelis–Menten kinetics. Zymography showed the existence of two amylase forms in crabs exposed to 35 (osmoconformation) and low (6–10 psu; hyper-regulation) or high (40 psu) (hypo-regulation) salinities. Carbohydrases activity in the hepatopancreas and glycemia were not affected in crab exposed to different environmental salinities. In 6 and 40 psu, the glycogen content in anterior gills was lower than in 35 psu. In 6, 10 and 40 psu, glycogen concentration in hepatopancreas, muscle and posterior gills were similar to that in 35 psu. Free glucose concentration in chela muscle was higher in 6 and 40 psu than in 35 psu. The existence and biochemical characteristics of carbohydrases activity and the adjustments in concentration of glycogen in anterior gills and free glucose in chela muscle suggests the ability to perform complete hydrolysis of glycogenic substrates and to keep glucose homeostasis in relation to acclimation to different salinity conditions.Fil: Asaro, Antonela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencia Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras; ArgentinaFil: Paggi, Roberto Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: del Valle, Juana Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencia Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras; ArgentinaFil: Lopez Mañanes, Alejandra Antonia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencia Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras; Argentin

Amylase in the hepatopancreas of a euryhaline burrowing crab: Characteristics and modulation

In spite of its inherent physiological importance, studies on the occurrence, characteristics, and modulation of amylase in euryhaline crabs are lacking. We investigated the occurrence of amylase forms and the effect of acclimation to different salinities on their number and made a partial purification and characterization of the major form present in the hepatopancreas of Neohelice granulata. Zymogram analysis revealed 5 amylase forms in crabs acclimated to 35 psu (seawater) and 37 psu, and an additional band at 10 psu, but with a major form (29 kDa) in all cases, which was partially purified and characterized. Amylolytic activity was maximal between 30 and 40 °C; maintained at high NaCl concentrations (up to 4 M); increased by 5 mM K+, Li+, Co2+, and Mg2+ (36%–45%); inhibited by Cu2+, Zn2+, Cd2+, Fe2+, and Mn2+ (92.4% and 23.7%); not affected by Ni2+ or Ba2+; and enhanced almost 100% by Ca2+. Amylase exhibited Michaelis–Menten kinetics (starch: Km = 1.24 mg mL–1; glycogen: Km = 16.19 mg mL–1). The potential physiological significance and relationship to habitat conditions of the extra form in low salinity and the biochemical characteristics of the partially purified amylolytic activity (halotolerant, differential sensitivity to ions, capability to hydrolyze starch and glycogen) are discussed.Fil: Asaro, Antonela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencia Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras; ArgentinaFil: Paggi, Roberto Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: de Castro, Rosana Esther. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Lopez Mañanes, Alejandra Antonia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencia Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras; Argentin

Global role of the membrane protease LonB in Archaea: Potential protease targets revealed by quantitative proteome analysis of a lonB mutant in Haloferax volcanii

The membrane-associated LonB protease is essential for viability in Haloferax volcanii, however, the cellular processes affected by this protease in archaea are unknown. In this study, the impact of a lon conditional mutation (down-regulation) on H. volcanii physiology was examined by comparing proteomes of parental and mutant cells using shotgun proteomics. A total of 1778 proteins were identified (44% of H. volcanii predicted proteome) and 142 changed significantly in amount (≥. 2 fold). Of these, 66 were augmented in response to Lon deficiency suggesting they could be Lon substrates. The "Lon subproteome" included soluble and predicted membrane proteins expected to participate in diverse cellular processes. The dramatic stabilization of phytoene synthase (57 fold) in concert with overpigmentation of lon mutant cells suggests that Lon controls carotenogenesis in H. volcanii. Several hypothetical proteins, which may reveal novel functions and/or be involved in adaptation to extreme environments, were notably increased (300 fold). This study, which represents the first proteome examination of a Lon deficient archaeal cell, shows that Lon has a strong impact on H. volcanii physiology evidencing the cellular processes controlled by this protease in Archaea. Additionally, this work provides a platform for the discovery of novel targets of Lon proteases. Biological Significance: The proteome of a Lon-deficient archaeal cell was examined for the first time showing that Lon has a strong impact on H. volcanii physiology and evidencing the proteins and cellular processes controlled by this protease in Archaea. This work will facilitate future investigations aiming to address Lon function in archaea and provides a platform for the discovery of endogenous targets of the archaeal-type Lon as well as novel targets/processes regulated by Lon proteases. This knowledge will advance the understanding on archaeal physiology and the biological function of membrane proteases in microorganisms.Fil: Cerletti, Micaela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Paggi, Roberto Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Ramallo Guevara, Carina. Ruhr Universität Bochum; AlemaniaFil: Poetsch, Ansgar. Ruhr Universität Bochum; AlemaniaFil: de Castro, Rosana Esther. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentin