Seleção de péptidos específicos para células do cancro do colon através do uso de bibliotecas de péptidos expressas na superfície de fagos

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biológica (área de especialização em Tecnologia Química e Alimentar)Colorectal cancer (CRC), localized to the large intestine and rectum, is the third most commonly diagnosed cancer and the second leading cause of cancer death. At the molecular level, CRC is a heterogeneous disease. This heterogeneity, currently not covered by available screening tests, translates into differences in the disease progression and also in the response to chemotherapeutic agents which proves that there is an undeniable need for improved diagnostic and screening tools capable of distinguish cancer at a molecular level. The main goal of this thesis was the development of a multifunctional phage-based nanoparticle to detect and report the presence of cancer cells on a given sample through the use of a biosensor. Particularly, M13KE phage particle was genetically modified to accomplish a recombinant product capable of recognizing poorly differentiated colon cancer cells (RKO cell line) and report their presence using bioluminescence. The element of this particle that allowed targeting RKO cells was obtained using phage-displayed random peptide libraries to screen the surface of these cells towards the identification of biomarkers (i.e. membrane proteins) and specific peptide ligands. For that purpose, two types of random peptide libraries (presenting seven linear peptides - Ph.D. 7 and twelve linear peptides - Ph.D. 12) were cloned into the genome of the M13KE filamentous phage. Constructed libraries and a commercial one (Ph.D. C7CTM from New England Biolabs®) were used to perform two methodologies of phage display and biopanning in order to find specific peptide ligands with affinity to RKO cells. The affinity of the phage pools obtained through biopanning was assessed using ELISA methodology. As a result of these experiments, a new specific peptide, CIGNSNTLC, with high affinity towards RKO cells was discovered. In order to confer to the phage the ability to produce a bioluminescent signal, the insertion of NanoLucTM gene into the M13KE genome was also attempted, at the 5’ end of gene VIII in order to obtain 2700 copies of NanoLucTM luciferase coupled to pVIII M13KE major coat protein. The presence of this enzyme on the phage would function as a reporter of the presence of a specific biomarker on a given sample and the amount of signal could be related to the amount of that biomarker. In summary, the results herein gathered highlight that phage display is a powerful tool to find new peptide ligands capable of targeting cancer cells. In addition, the construction of a phage particle capable of recognizing and report the presence of biomarkers on a given sample will be a major advance on the use of biosensors for cancer diagnosis.O cancro colorectal, localizado no intestino grosso e no recto, é o terceiro cancro mais diagnosticado e a segunda causa de morte relacionada com doenças oncológicas. O cancro colorectal é uma doença muito heterogénea a nível molecular. Esta heterogeneidade que se traduz em diferenças na progressão da doença e na resposta dos pacientes aos agentes quimioterápicos, não é, atualmente, abrangida pelos testes diagnósticos usados o que prova, inegavelmente, que há uma necessidade de encontrar métodos de diagnóstico mais eficazes e capazes de distinguir esta doença ao nível molecular. O objetivo principal desta tese foi o desenvolvimento de uma nanopartícula fágica multifuncional para detetar e reportar a presença de células cancerígenas numa dada amostra, através do uso de um biossensor. Em particular, foi planeada a modificação do fago M13KE para obter um produto recombinante capaz de reconhecer células pouco diferenciadas do cancro do colon (de uma linhagem celular denominada RKO), e reportar a sua presença através de bioluminescência. O elemento desta partícula fágica que possibilita o reconhecimento das células RKO foi obtido usando bibliotecas de fagos acopladas à cápside da partícula fágica para rastrear a superfície celular destas células e identificar biomarcadores (proteínas membranares) e ligandos específicos. Com esse objetivo, dois tipos de bibliotecas fágicas (com uma sequência peptídica linear de 7 peptidos – Ph.D. 7, e de 12 péptidos – Ph.D. 12) foram geneticamente construídas usando o fago filamentoso M13KE. As bibliotecas construídas, em conjunto com uma terceira biblioteca comercial (Ph.D. C7CTM da New England Biolabs®) foram usadas para proceder a duas metodologias de phage display e biopanning para encontrar ligandos peptídicos específicos com afinidade para as células RKO. A afinidade dos complexos fágicos obtidos através dos ensaios de biopanning foi avaliada através de ensaios de ELISA. Como resultado das atividades experimentais apresentadas descobriu-se uma nova sequência peptídica, CIGNSNTLC, com grande afinidade para as células RKO. Com o objetivo de conferir a capacidade de produzir um sinal luminescente ao fago, tentou-se inserir o gene NanoLucTM no vetor M13KE por forma a conseguir o acoplamento da NanoLuc® luciferase às 2700 cópias da proteína VIII da cápside do fago. Em suma, os resultados desta tese evidenciaram que o phage display é uma ferramenta poderosa para encontrar novos ligandos capazes de reconhecer células cancerígenas. Adicionalmente, a construção de uma partícula fágica capaz de reconhecer e reportar a presença de biomarcadores numa dada amostra será um grande avanço no uso de biosensores para o diagnóstico de cancro

The subjectivity of the Werewolf (São Bernardo)

O ensaio concentra-se na análise da trajetória social de Paulo Honório, narrador-protagonista de São Bernardo, e busca interpretar o sentido da conjunção entre lirismo, dinheiro e melancolia no livro.This essay focuses on the analysis of the social course of the narrator-protagonist of São Bernardo, seeking to grasp the sense of the conjunction between lyricism, money and melancholy in the book

The peasant and the prosecutor of the poor: Barren Lives

The experimental character in Graciliano Ramos’ novel, Barren Lives, allows the apprehension of the social fracture considering the contradictions between the narrator-intellectual and the stream of consciousness of a peasant family, driven away by the drought. Labor itself comes to the fore, in a context in which the local oligarchies see their own downfall (the coffee crises of 1929), a patriarchal national-populism arises (the Getulio Vargas’ era), and a critical imagination takes place.O ensaio busca iluminar o caráter experimental do romance Vidas Secas, de Graciliano Ramos, o qual permite a apreensão da fratura social brasileira a partir das contradições entre o narrador-intelectual e a representação da consciência de uma família de retirantes empurrada pela seca. Num contexto de queda das oligarquias (a crise do café de 1929), de populismo nacional-patriarcalista (a era Vargas) e de imaginação crítica, as relações de trabalho vêm ao procênio, funcionando como princípio formal do livro

Uma realidade que ficcionalizou a si mesma:: história e subjetividade em Vento sul, de Vilma Arêas

O artigo busca compreender como se dá a representação da realidade no livro Vento sul, de Vilma Arêas, a partir da indagação de procedimentos simétricos opostos de composição nele radicalizados: a desliterarização e o artifício poético-literário. Trata-se de apreender o teor da história e do sujeito que o livro configura, e de refletir sobre um veio da literatura brasileira contemporânea

Fascismo e natureza: imagens desconcertantes da pedagogia do sr. Keuner

O artigo busca analisar três das Histórias do Sr. Keuner, que tematizam as relações entre natureza e capitalismo, seja discutindo as relações de propriedade, exploração e dominação social transpostas ao fundo do mar, seja detectando o fim do mito do “mal natural”, ao produzir um instantâneo do assassinato de um criminoso por forças sociais que o ultrapassam. Assim, tem-se em vista compreender as Histórias como um laboratório de formas na contramão de lugares-comuns, palavras de ordem e regras de comportamento do “cidadão de bem”, a fim de estudar as formas do nazifascismo que adentravam a consciência

Cidade-cárcere: violência e representação das classes baixas na literatura brasileira contemporânea

O ensaio tem por objeto de reflexão parte da literatura contemporânea brasileira, dentro do campo específico rotulado como “marginal”, indagando suas bases em nossa tradição histórico-literária e os sentidos daquilo que a crítica avessa a essa produção nomeia como “neodocumentalismo”. A hipótese a testar é de que, em seus melhores momentos, haja continuidade da herança modernista, com significativa diferença de tom e horizonte político. Centralmente, busca-se comparar os modos de figuração das vozes das camadas baixas na literatura brasileira de hoje com aqueles presentes em obras do primeiro Modernismo. Por fim, questiona-se o sentido da emersão literária dessas vozes das classes baixas no cenário do capitalismo avançado

Bars and boxes

A seção Criação tem por objetivo publicar textos e materiais inéditos de escritores e/ou artistas, fotógrafos, desenhistas, além de documentos inéditos encontrados no Arquivo do IEB/USP. “Grades e caixas”, de Ana Paula Pacheco, reúne dois contos sobre o feminino. Pacheco é escritora e professora de Teoria Literária e Literatura Comparada na Universidade de São Paulo. “Pedaços de sonho, seguidos de considerações tecidas pelo Urso siberiano” se beneficia de estudos de Freud (1972), e de narrativas de Schnitzler (1987; 2008) e de Nastassja Martin (2021). “Pandora, a barata” incorpora livremente estudos de Erwin e Dora Panofsky (2009).The Creation section has the objective of publish unpublished texts and materials by writers and/or artists, photographers, designers, as well as unpublished documents found in the USP IEB Archive. “Bars and boxes”, by Ana Paula Pacheco, gathers two tales about the feminine. Pacheco is writer and professor of Literary Theory and Comparative Literature in the Sao Paulo University. “Pedaços de sonho, seguidos de considerações tecidas pelo Urso siberiano” benefits from the studies by Freud (1972), Schnitzler (1987; 2008) and Nastassja Martin (2021). In addition, “Pandora, a barata” freely incorporates the studies by Erwin and Dora Panofsky (2009). &nbsp

Astúcia de classe: "Famigerado", de Guimarães Rosa, e o lugar do escritor

No quadro social imaginado por Grande sertão: veredas, jagunços heróicos e bandidos do sertão dividem o Bem e o Mal, sobre o panode-fundo da Primeira República. Em Primeiras estórias, de outro modo, a nova matéria histórica, remetendo ao quadro da modernização brasileira nos anos J.K., parece colocarem xeque a estetização literária. O ex-jagunço é agora um “homem livre pobre”. No duelo -- apenas verbal -- entre sertão e cidade, o lugar de classe do escritor vem à tona

Characterization of hairy1 and hairy2 pattern expression during lung development of Gallus gallus

Dissertação de mestrado em Genética MolecularAlthough much is known about some aspects of lung development, the mechanisms that regulate the spatiotemporal control of this process are not well defined. The identification of a segmentation clock that ensures the correct spatiotemporal periodicity of somite generation, during chick somitogenesis, provided the first molecular evidence of how embryonic cells count time. The underlying mechanisms of this process involve the oscillation of "clock-genes" like hairy1 and hairy2 (members of hairy-enhancer-of-split –HES- family of transcriptional repressors), which are intimately related to the Notch signaling pathway. More recently, hairy2 expression unveiled a molecular clock operating during limb development. Lung development share some similarities with somitogenesis and limb development, namely: they all occur along the rostro-caudal axis, the signaling pathways implicated are the same, the formation of consecutive repetitive structures along the anterior-posterior axis is observed, and they occur with exact chronological precision. Considering this parallelism, the characterization of hairy1 and hairy2 during lung branching morphogenesis of Gallus gallus became relevant, since their expression might indicate a possible role in the development of this tissue, although their functions are not yet clarified. Moreover, taking into consideration that FGF and Notch signaling pathways are involved in the molecular clock mechanisms, the link between hairy1 and hairy2, these pathways and branching morphogenesis was assessed by lung explant culture system. The present work characterizes, for the first time, hairy1 and hairy2 expression pattern in early stages of chick lung development, by in situ hybridization. hairy1 expression was evident mainly in the pulmonary epithelium of the respiratory tract, but also in the mesenchyme. hairy2 expression was evident mainly in the chick pulmonary mesenchyme surrounding the trachea and the trachea bifurcation, and the most distal region of the main bronchus. hairy1 and hairy2 expression was not affected by FGF signaling inhibition; however, treated explants showed atypical lung branching when compared with control ones, which is consistent with the role of FGF signaling in branching morphogenesis. These results indicate that these genes are not downstream targets of FGF signaling pathway in the chick lung. Notch inhibition did not affect hairy1 expression but, on the other hand, hairy2 expression was dramatically reduced when compared with control explants. Moreover, treated explants showed not only an increased number of secondary branches but also an anomalous lung structure in the distal tip of the main bronchus. Notch signaling inhibition appears to affect only hairy2 expression in the lung and seems to interfere with the correct process of lung development.Hoje em dia muito se sabe sobre desenvolvimento pulmonar. No entanto, os mecanismos que regulam o controlo espacial e temporal deste processo não estão bem definidos. A identificação de um relógio molecular da segmentação responsável pela correcta periodicidade espacial e temporal da formação dos sómitos no modelo da galinha, forneceu a primeira evidência molecular de como de como é feita a contagem do tempo pelas células embrionárias. Os mecanismos subjacentes a este processo envolvem a oscilação de genes como hairy1 e hairy2 (membros da família de repressores de transcrição hairy-enhancer-of-split, HES), que estão intimamente relacionados com a via de sinalização Notch. Mais recentemente, foi descrita a existência de um relógio molecular no desenvolvimento do membro. O desenvolvimento pulmonar partilha algumas semelhanças com a somitogénese e o desenvolvimento do membro, nomeadamente: ocorre ao longo de um eixo rostro-caudal, as vias de sinalização implicadas são as mesmas, observa-se a formação consecutiva de estruturas repetitivas ao longo de um eixo anterior-posterior, e ocorre com precisão cronológica. Considerando este paralelismo, tornou-se relevante caracterizar o padrão de expressão de hairy1 e hairy2 durante a ramificação pulmonar de Gallus gallus, uma vez que a sua expressão pode indicar um possível papel no desenvolvimento deste tecido. Além disso, tendo em conta que as vias de sinalização Notch e FGF estão envolvidas nos mecanismos do relógio molecular, estas vias conjuntamente com a relação entre hairy1 e hairy2 e a ramificação pulmonar foram avaliadas. O presente trabalho caracteriza, pela primeira vez, o padrão de expressão de hairy1 e hairy2 em estadios iniciais do desenvolvimento pulmonar de galinha, por hibridização in situ. A expressão de hairy1 foi observada principalmente no epitélio pulmonar do tracto respiratório, mas também no mesênquima. hairy2 é expresso sobretudo no mesênquima pulmonar de galinha que rodeia a traqueia e a bifurcação da traqueia, e na região mais distal do brônquio principal. A expressão destes genes não foi afectada pela inibição da via FGF, indicando que estes genes não são alvos desta via de sinalização neste órgão. No entanto, estes explantes apresentaram uma ramificação pulmonar atípica, o que está de acordo com o papel da via FGF na ramificação pulmonar. A inibição da via Notch não afectou a expressão de hairy1 mas, a expressão de hairy2 foi dramaticamente reduzida. Além disso, os explantes tratados com DAPT apresentaram não só um aumento no número de ramificações secundárias mas também uma estrutura pulmonar anómala. A inibição da via Notch parece afectar a expressão de hairy2 em regiões concretas do pulmão e parece interferir no correcto processo de desenvolvimento pulmonar