Morphological and functional evaluation of the tracheal mucociliary clearance of rats submitted to different methods of preservation after cold ischemia

INTRODUÇÃO: O transplante traqueal continua um desafio. Contudo, avanços nas técnicas de revascularização dos enxertos traqueais e no conhecimento da imunobiologia da traquéia, indicam que esta técnica pode ser utilizada com freqüência no futuro próximo. A depuração mucociliar (DM) é o mecanismo de defesa inato mais importante das vias aéreas. A traquéia age como um órgão de defesa devido à DM. A DM ocorre por ação do batimento ciliar do epitélio respiratório que impele o muco que atapeta as vias respiratórias, carreando substâncias nocivas. Idealmente, a DM deve ser preservada em enxertos traqueais passíveis de utilização para transplante traqueal. Nosso intuito foi: 1) avaliar os efeitos da isquemia fria sobre a DM; e 2) avaliar a ação de soluções de preservação administradas por via tópica na manutenção da DM após isquemia fria. MÉTODOS: De 109 ratos Wistar foram obtidos 217 segmentos traqueais. Os segmentos foram distribuídos entre três grupos experimentais e um grupo Controle. Cada segmento foi submergido em LPD-glicose (grupo LPD), histidina-triptofano-cetoglutarato (grupo HTK) ou solução salina (grupo Salina). Avaliou-se a DM após 6,10,16 ou 24 horas de isquemia fria. No grupo Controle os segmentos foram analisados imediatamente após a extração, não havendo isquemia fria, nem submersão em soluções. A velocidade de transporte mucociliar (VTM) foi medida através de microscópio de luz, pela observação do movimento das partículas de muco na superfície dos segmentos traqueais. A freqüência de batimento ciliar (FBC) foi obtida pela sincronização entre o movimento ciliar observado pelo microscópio de luz e um estroboscópio. Em seguida, os segmentos foram corados com hematoxilina-eosina para analisar a integridade epitelial (IE) e a inflamação subepitelial (IS). Foi realizada análise quantitativa do muco intracelular por um programa de computador após coloração com azul de alcião (MI-AA) e PAS (MI-PAS). As amostras mais significativas foram analisadas qualitativamente por microscopia eletrônica de transmissão (ME). Foram realizadas duas análises: 1) grupo Controle e tempos de isquemia; e 2) grupo Controle e soluções de preservação (agrupado pelo tempo de isquemia). RESULTADOS: 1) grupo Controle e tempos de isquemia: O grupo controle foi melhor que os grupos submetidos a isquemia fria quanto à VTM (p=0,0001) e FBC (p=0,012). Contudo, não houve diferença na IE, IS e MI entre o grupo Controle e os demais grupos. 2) grupo Controle e soluções de preservação: O grupo controle apresentou melhor VTM que os grupos LPD, HTK e Salina após isquemia de 6h (p=0,001), 16h (p=0,009) e 24h (p=0,001). O grupo controle apresentou melhor FBC que os grupos LPD, HTK e Salina após isquemia de 24h (p=0,001). Não houve diferença entre os grupos na IE e IS. O grupo Controle apresentou melhor MI-AA que os grupos LPD após 16h (p=0,02) e HTK após 24h de isquemia (p=0,04). Não houve diferença entre os grupos à MI-PAS. À ME, o grupo Salina apresentou maiores alterações secundárias à isquemia do que os demais grupos. CONCLUSÕES: 1) A isquemia fria piora a DM; e 2) O uso de soluções de preservação administradas por via tópica não contribui para manutenção da DM após isquemia friaINTRODUCTION: Tracheal transplantation is a challenging problem. Recent advances in graft revascularization, and reepithelialization renewed the interest on airway transplantation. Mucociliary clearance (MC) is the most important innate defense mechanism of the respiratory system. MC works by mucous transport carried out by ciliary beating function of the airway epithelium. Trachea acts as a defense organ in the respiratory system through the MC. Ideally, MC should be preserved in tracheal grafts used for transplantation. Preservation solutions improve organ preservation by decreasing ischemic injury. The purpose of the study was: 1) to evaluate the effects of cold ischemia on MC; and 2) to evaluate the impact of topically-applied preservation solutions on MC after cold ischemia. METHODS: From 109 male Wistar rats we obtained 217 tracheal segments. The segments were allocated to one of four groups. Segments were submerged in LPD-glucose (LPD group), histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK group), or saline solution (Saline group), and stored at 4C. MC was analyzed after 6, 10, 16 or 24h of ischemia. Control group have only segments that were analyzed right after extraction, not submitted to cold ischemia or submersion in preservation solutions. The mucociliary transport velocity (MTV) was measured by observation of mucous particle under the surface of the segments, through a light microscope. Ciliary beating frequency (CBF) was achieved by synchronization between cilia movement and a stroboscope flashlight. Tracheas were stained with hematoxylin-eosin in order to analyze the epithelial integrity (EI) and the subepithelial inflammation (SI). A quantitative analysis of the intracellular mucus stained with alcian blue (IM -AB) and PAS (IM-PAS) was achieved by a software. The most significant samples of the tracheal segments were qualitatively analyzed by transmission electronic microscopy (TEM). Two analyses were made: 1) Control group and ischemic time; and 2) Control group and preservation solutions. RESULTS: 1) Control group and ischemic time: Control group had better VTM (p=0,0001) and CBF (p=0,012) than the groups submitted to cold ischemia. However, there was no difference among Control group and the other groups on EI, SI, IM-AB, and IM-PAS. 2) Control group and preservation solutions: Control group showed better MTV than the LPD, HTK, and Saline groups after 6h (p=0,001), 16h (p=0,009) and 24h (p=0,001) of cold ischemia. Control group showed better CBF than the LPD, HTK, and Saline groups after 24h of ischemia (p=0,001). There was no difference among groups on EI and SI. Control group showed better IM-AB than both the LPD group after 16h of cold ischemia (p=0,02), and the HTK group after 24h of cold ischemia (p=0,04). There was no difference among the groups on IM-PAS. TEM showed more findings of ischemic lesion on Saline group. CONCLUSIONS: 1) Cold ischemia impairs MC; and 2) Topically-applied preservation solutions do not ameliorate MC after cold ischemi