Apoptotic Effects of Etodolac in Breast Cancer Cell Cultures

Nonsteroidal anti‐inflammatory drugs (NSAIDs) are commonly used as anti‐inflammatory and analgesic agents. This family of drugs suppresses prostaglandin synthesis through inhibition of cyclooxygenase (COX) enzymes. Recent studies displayed that anti‐carcinogenic actions of these drugs are mediated by COX‐2 enzyme. Currently, there is intense research on COX‐2 inhibitors as therapeutic targets. Etodolac is not perfectly selective but shows ‘preferential selectivity’ for COX‐2. Here, in this study, we wanted to take gene expression snapshots of several apoptotic proteins under different conditions of drug exposure. The aim, therefore, focused to determine differential effects of etodolac on the regulation of apoptotic genes in hormone‐responsive MCF‐7 and triple‐negative MDA‐MB‐231 cancer cell lines. Our data suggest that MDA‐MB‐231 is more responsive to etodolac exposure. Cell proliferation and apoptosis consistently regulated upon drug addiction. Furthermore, COX‐2/HER2 was explicitly an up‐regulated, phosphorylated form of Bad accumulated and anti‐apoptotic proteins SAG and survivin increased in both transcriptional and translational levels. Changes in mitochondrial Bcl‐2 family proteins were moderate and pro‐ and anti‐apoptotic proteins showed similar levels of regulation in both cell lines. We believe that these findings would be supportive for future studies targeting etodolac‐based therapies, as it reveals apoptotic factors differentially regulated in hormone‐responsive and invasive cell lines

G proteinleri üzerine yapı ve işlev çalışmaları

Bu çalışmada merkezi sinir sisteminde yaygın olarak bulunan yapısı ve işlevi henüz açiklığa kavuşmamış olan Goα proteininin rekombinant olarak E.Coli’den saflaştırılması amaçlandı. Rekombinant Goα cDNA’sının, alıcı hücre olarak E.Coli Top10 hücreleri kullanılarak, pQE80 vektör sistemine alt klonlanması gerçekleştirildi. En uygun ekspresyon düzeyi farklı IPTG koşullarında ve farklı sıcaklıklarda belirlendi. 1 mM IPTG derişimimde 25oC’taki sıcaklıkta yüksek miktarda çözünür protein eldesinin mümkün olduğu saptandı. His etiketli Goα proteini Ni-NTA ilginlik kromotografisi kullanılarak saflaştırıldı. Saflaştırmanın her aşamasındaki protein miktarları Lowry yöntemiyle belirlendi. Elde edilen Goα proteinlerinin analizi SDS-PAGE ve Goα proteinine özgül antikor kullanarak Western emdirimi analizi ile gerçekleştirildi. Afinite kromotografisinden elde edilen proteindeki safsızlıklardan kurtulmak için, protein Sephadex G-100 (moleküler elek kromotografisi) kolonuna verildi. Böylelikle ikinci bir saflaştırma işlemi uygulanmış oldu. Protein etkinliğini belirlemek üzere floresans ölçümleri yapıldı. Proteinin içsel floresans spektrumları elde edildi. Proteinin guanin nükleotid bağlama etkinliği BODIPY FL-GTPγS probu kullanılarak gösterildi. Guanin nükleotid bağlama etkinliği ayrıca, GTP’nin hidrolizlenmeyen analoğu [35S]GTPγS kullanılarak belirlendi. Kullanılan pQE80 ekspresyon sistemiyle etkin Goα proteininin çözünür kesimden eldesi mümkün olmuştur. SUMMARY This study was designed to overexpress and purify recombinant Goα protein, the most abundant type of G-protein in the nervous system. Goα protein was subcloned into the pQE80 vector system. Recombinant Goα was expressed in E.Coli Top10 cells that were transformed with pQE80 plasmid. Optimum expression levels were determined by using different IPTG concentrations and temperatures for induction. Soluble protein was obtained by overnight induction with 1mM IPTG at 25oC. His-tagged Goα protein was purified with Ni-NTA affinity chromatography. The protein was further purified by Sephadex G-100 gel filtration chromotography. The quantity of protein was detected by the Lowry method. The presence of Goα was monitored by SDS-PAGE and Western blot analysis by using monoclonal Goα antibody. Fluorescent measurement assays were performed in order to demonstrate the intrinsic fluorescence of Goα protein. The intirinsic florescence of protein was determined from its emission spectroscopy. The guanine nucleotide binding activity of Goα protein was demonstrated by using the BODIPY FL-GTPγS probe. The guanine nucleotide binding activity of Goα protein was also measured by [35S]GTPγS binding assay. In conclusion, we were able to purify active Goα protein by using the pQE80 expression vector system

Düşük frekanslı elektromanyetik alan uygulanan T- lenfositlerinin membran potansiyellerinin incelenmesi

ÖZETDüşük frekanslı elektromanyetik alanların mitojen ile indüklenmiş lenfositlerin üzerinde olumlu ve olumsuz etkileri olduğu önceki çalışmalarla gösterilmekle birlikte, etki mekanizması bilinmemektedir. Yapılan önceki çalışmalarda mitojen ile indüklenmiş lenfositlerin çoğalması sırasında membran potansiyellerinin değiştiği saptanmıştır. Bu çalışmada düşük frekanslı elektromanyetik alanın mitojen ile indüklenmiş lenfositlerin membran potansiyelinde meydana getirebileceği değişiklikler ve buna paralel olarak lenfosit çoğalmasında meydana gelen değişiklikler floresans spektroskopisi yöntemi kullanılarak araştırılmıştır.Sağlıklı insan kanından ayrılan T lenfositleri manyetik alana konulmadan önce 72 saat RPMI-1640 içeren hücre kültür ortamında inkübe edilmiş bu kültürden kontrol ve manyetik alan olmak üzere iki grup oluşturulmuştur. Hücreler 90 dakika manyetik alana maruz bırakıldıktan sonra di-4-ANNEPS probu kullanılarak floresans spektroskopik ölçümleri yapılmıştır.Spektroskopik ölçümlerde manyetik alan ve kontrol grubu için 440 nm ve 506 nm dalga boylarındaki floresans şiddetleri belirlenmiştir. Belirlenen bu şiddetlerle önceden hazırlanan kalibrasyon eğrisi kullanılarak kontrol ve manyetik alana maruz kalan gruplar arasındaki membran potansiyel farkı araştırılmıştır. Bu çalışmaya paralel olarak bu iki grubun çoğalması arasında bir fark olup olmadığı tespit edilmiştir.Düşük frekanslı manyetik alana maruz bırakılan lenfosit grubunun çoğalmasında kontrol grubuna göre bir azalma saptanmıştır. Lenfositlerin membran potansiyellerinde hiperpolarizasyon durumu saptanmıştır.SUMMARYIn recent years a body of data on the interactions of extremely low electromagnetic fields with biological systems has accumulated. However the mechanism of this interaction has not been elucidated yet.Previous studies have shown that mitogen induced proliferation of lymphocytes is accompanied by a change in electrical potential of the cell and any change in membrane potential causes a change in the proliferative response of the cell.This work aimed to corelate proliferation with a change in membrane potential that the extremely low electromagnetic fields may induce in the cell.Lymphocytes obtained from healthy donors were grown in culture in RPMI medium for 72 hours before magnetic field was applied. Magnetic field was applied for 90 minutes and the control group was kept in similar conditions. Using di-4-Anepps as a probe, fluorescence spectroscopy was used to determine membrane potential.The ratio of fluorescence intensity at two wavelengths, 440 nm and 506 nm, was taken for both magnetic field-applied and control groups to determine a change in potential.Results showed hyperpolarization for magnetic field-applied lymphocytes with respect to control group. A decrease in proliferation was observed for the magnetic field-applied cells

Düşük frekanslı elektromanyetik alan uygulanan T- lenfositlerinin membran potansiyellerinin incelenmesi

Düşük frekanslı elektromanyetik alanların mitojen ile indüklenmiş lenfositlerin üzerinde olumlu ve olumsuz etkileri olduğu önceki çalışmalarla gösterilmekle birlikte, etki mekanizması bilinmemektedir. Yapılan önceki çalışmalarda mitojen ile indüklenmiş lenfositlerin çoğalması sırasında membran potansiyellerinin değiştiği saptanmıştır. Bu çalışmada düşük frekanslı elektromanyetik alanın mitojen ile indüklenmiş lenfositlerin membran potansiyelinde meydana getirebileceği değişiklikler ve buna paralel olarak lenfosit çoğalmasında meydana gelen değişiklikler floresans spektroskopisi yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Sağlıklı insan kanından ayrılan T lenfositleri manyetik alana konulmadan önce 72 saat RPMI-1640 içeren hücre kültür ortamında inkübe edilmiş bu kültürden kontrol ve manyetik alan olmak üzere iki grup oluşturulmuştur. Hücreler 90 dakika manyetik alana maruz bırakıldıktan sonra di-4-ANNEPS probu kullanılarak floresans spektroskopik ölçümleri yapılmıştır. Spektroskopik ölçümlerde manyetik alan ve kontrol grubu için 440 nm ve 506 nm dalga boylarındaki floresans şiddetleri belirlenmiştir. Belirlenen bu şiddetlerle önceden hazırlanan kalibrasyon eğrisi kullanılarak kontrol ve manyetik alana maruz kalan gruplar arasındaki membran potansiyel farkı araştırılmıştır. Bu çalışmaya paralel olarak bu iki grubun çoğalması arasında bir fark olup olmadığı tespit edilmiştir. Düşük frekanslı manyetik alana maruz bırakılan lenfosit grubunun çoğalmasında kontrol grubuna göre bir azalma saptanmıştır. Lenfositlerin membran potansiyellerinde hiperpolarizasyon durumu saptanmıştır. SUMMARY In recent years a body of data on the interactions of extremely low electromagnetic fields with biological systems has accumulated. However the mechanism of this interaction has not been elucidated yet. Previous studies have shown that mitogen induced proliferation of lymphocytes is accompanied by a change in electrical potential of the cell and any change in membrane potential causes a change in the proliferative response of the cell. This work aimed to corelate proliferation with a change in membrane potential that the extremely low electromagnetic fields may induce in the cell. Lymphocytes obtained from healthy donors were grown in culture in RPMI medium for 72 hours before magnetic field was applied. Magnetic field was applied for 90 minutes and the control group was kept in similar conditions. Using di-4-Anepps as a probe, fluorescence spectroscopy was used to determine membrane potential.The ratio of fluorescence intensity at two wavelengths, 440 nm and 506 nm, was taken for both magnetic field-applied and control groups to determine a change in potential. Results showed hyperpolarization for magnetic field-applied lymphocytes with respect to control group. A decrease in proliferation was observed for the magnetic field-applied cells

Anti-Cancer Acitivity of Etodolac and Its Derivatives on Prostate and Colorectal Cancer Cell Lines

Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are commonly used as anti-inflammatory and analgesic agents. This family of drugs suppresses prostaglandin synthesis through inhibition of cyclooxygenase (COX) enzymes. Recent studies showed that anti-carcinogenic effects of these drugs are especially mediated by COX-2 enzyme. Etodolac is a COX-2 inhibitor and though not perfectly selective, it exhibits “preferential selectivity„ for COX-2. In this study, the anti-proliferative and apoptotic effects of etodolac and its hydrazone or triazole derivatives (SGK 206 and SGK 242, respectively), were investigated on prostate cancer cell line PC-3 and human colorectal carcinoma cell line HT-29. Our data showed that SGK 206 and SGK 242 were more effective in the inhibition of proliferation and induction of apoptosis compared to etodolac in both cell lines