21 research outputs found
Understanding sperm quality for improved reproductive performance
The assessment of semen quality is used to identify factors that influence sperm performance and diagnose male infertility [...
Estudio de la influencia de la progesterona sobre la selecci贸n esperm谩tica
La progesterona (PG) es una hormona fundamental en la reproducci贸n de los mam铆feros que regula la expresi贸n g茅nica del eje hipot谩lamo-hipofisario-gonadal por medio de receptores nucleares. Est谩 presente en el tracto reproductor femenino, y dado que, el espermatozoide presenta receptores para esta hormona en la membrana plasm谩tica, se ha especulado que la PG adem谩s, podr铆a regular la funcionalidad esperm谩tica por medio de r谩pidas acciones no gen贸micas. Entre estas acciones podr铆a incluirse el control de la capacitaci贸n, que es el conjunto de cambios que sufre el espermatozoide en el tracto reproductor femenino y que le confieren capacidad fecundante. Asimismo, tambi茅n podr铆a influir en la capacidad de guiar al espermatozoide hacia el ovocito, esencial para el 茅xito de la fecundaci贸n. Hasta la fecha no hay estudios sobre el efecto de la PG en la funcionalidad y en la orientaci贸n esperm谩tica en la especie ovina. En consecuencia, el objetivo principal de este trabajo fue analizar el efecto de la PG sobre los espermatozoides ovinos, determinando su influencia en la funcionalidad esperm谩tica y su capacidad quimioatrayente. Para ello, se realiz贸 un proceso de selecci贸n esperm谩tica in vitro mediante la t茅cnica de swim-up/dextrano a帽adiendo PG a dosis 100 pM o 1 碌M en la capa superior de recogida y evaluando posteriormente el porcentaje de recuperaci贸n celular y la funcionalidad de los espermatozoides recuperados. Asimismo, se analiz贸 la capacidad quimiot谩ctica de la PG, tanto en espermatozoides frescos como sometidos a un proceso de capacitaci贸n in vitro, utilizando una c谩mara de an谩lisis de quimiotaxis y un software experimental desarrollado por el grupo. Ambas dosis de PG ensayadas dieron lugar a un incremento estad铆sticamente significativo del porcentaje de recuperaci贸n celular y de espermatozoides capacitados respecto al control, si bien no tuvieron efecto en la motilidad, en el estado de la membrana plasm谩tica (integridad de la misma y exposici贸n de fosfadidilserina) y la distribuci贸n del receptor de la PG en la superficie de los espermatozoides recuperados. Adem谩s, se demostr贸 la capacidad quimiot谩ctica de la PG sobre espermatozoides ovinos capacitados in vitro
Estudio de la posible acci贸n protectora de la melatonina frente al da帽o por fr铆o en espermatozoides ovinos
Las dosis seminales ovinas se suelen refrigerar para su uso a corto plazo en inseminaci贸n artificial. Los espermatozoides de la especie ovina son especialmente susceptibles al fr铆o, y su exposici贸n a bajas temperaturas produce una serie de cambios entre los que se incluyen p茅rdida de motilidad, de integridad de membrana, aumento de marcadores apopt贸ticos y una capacitaci贸n prematura o criocapacitaci贸n. La capacitaci贸n es un proceso complejo por el cual los espermatozoides adquieren capacidad fecundante, pero si esta se produce lejos del ovocito, el espermatozoide no ser谩 capaz de cumplir su misi贸n, por lo que una capacitaci贸n prematura consecuencia del fr铆o resulta indeseable. La melatonina es una hormona importante en la regulaci贸n de la reproducci贸n. El descubrimiento de la presencia de receptores para esta hormona en la superficie del espermatozoide ovino, indicar铆a una acci贸n directa de la misma sobre la funcionalidad de estas c茅lulas. Algunas de las rutas moleculares a trav茅s de las que act煤a la melatonina en algunas c茅lulas som谩ticas tambi茅n est谩n implicadas en la regulaci贸n de procesos fisiol贸gicos del espermatozoide, como la capacitaci贸n. Adem谩s, tambi茅n se atribuye un papel protector frente a la apoptosis en algunos tipos celulares. Por ello, en el presente trabajo se plante贸 la hip贸tesis de que la melatonina podr铆a tener un efecto de protecci贸n frente al fr铆o en espermatozoides, evitando los cambios relacionados con la criocapacitaci贸n y el aumento de marcadores apopt贸ticos. El objetivo de este estudio fue estudiar el efecto de diferentes concentraciones de melatonina a帽adidas a los espermatozoides antes de ser sometidos a bajas temperaturas, analizando distintos par谩metros relacionados con la funcionalidad esperm谩tica: motilidad, integridad de membrana, estado de capacitaci贸n (relacionado con la distribuci贸n del calcio intracelular y la fosforilaci贸n de tirosinas de prote铆nas de membrana) y marcadores apopt贸ticos. Los resultados obtenidos indican que la refrigeraci贸n directa a 5 潞C, aunque no afecta a la motilidad esperm谩tica, produce efectos subletales sobre los espermatozoides reflej谩ndose en una disminuci贸n importante del resto de par谩metros de calidad seminal. Las dosis de melatonina utilizadas (100 pM, 10 nM y 1 渭M) no mejoran de manera significativa los valores de motilidad e integridad de membrana, pero s铆 disminuye significativamente el porcentaje de espermatozoides capacitados si se incuba la muestra con las dosis de 100 pM y 10 nM previamente a la refrigeraci贸n. La melatonina, a dosis bajas (100 pM), disminuye el porcentaje de espermatozoides con marcadores apopt贸ticos como la inversi贸n de fosfatidilserina y la actividad de caspasas, si bien este descenso no es significativo. En conclusi贸n, en este estudio se demuestra que la melatonina es capaz de evitar, al menos parcialmente, la capacitaci贸n prematura asociada a fr铆o
In聽vitro approach points to a chemotactic effect of melatonin on ram spermatozoa
Sperm orientation mechanisms, such as chemotaxis, are essential for the sperm to reach the oocyte and fertilize it. Melatonin is secreted by the cumulus cells and is also present in the follicular fluid in mammals. The presence of membrane receptors for melatonin in ram spermatozoa, and its proven involvement in the sperm functionality, may suggest a possible role in the guided movement towards the oocyte. Hence, the objective of the present work is to study the in聽vitro potential chemotactic action of melatonin on ram spermatozoa, analysing the influence of the season (breeding and non-breeding) and the sperm capacitation state. The first experimental approach consisted in the inclusion of melatonin in the upper layer of a swim-up selection method. During the non-breeding season, the presence of melatonin at 100 pM and 1聽渭M concentrations significantly increased the cell recovery rate, and induced changes in the sperm location of the MT2 melatonin receptor, compared with the standard swim-up. Moreover, the selected sperm population with 100 pM melatonin presented a higher percentage of capacitated spermatozoa. The greater recovery rate obtained with melatonin could be due to the stimulation of sperm movement in random directions, i.e., a chemokinetic effect, or due to a guided movement (chemotaxis) towards the gradient of the melatonin. To elucidate this issue, together with the study of the influence of the sperm capacitation status, we performed a second experimental approach which consisted in the use of chemotaxis chambers and an open-source software (Open-CASA) that analyses the sperm trajectories towards the hormone gradient and calculates a chemotaxis index (SL index). There was a significant difference between the SL index in the presence of 1聽渭M melatonin and the control without hormone. This effect was only observed in capacitated spermatozoa with cAMP-elevating agents (Cap-CK samples) obtained during the non-breeding season. These results would point to an in聽vitro chemotactic effect of melatonin on ram spermatozoa, although chemokinesis cannot be ruled out. Nonetheless, the inclusion of this hormone in the swim-up procedure could enhance the sperm recovery rate
Estudio de las rutas moleculares implicadas en la acci贸n de la melatonina sobre la calcio-calmodulina kinasa II de los espermatozoides
La melatonina es una hormona sintetizada principalmente en la gl谩ndula pineal que est谩 implicada en la regulaci贸n de muchos procesos biol贸gicos, entre los que se encuentra la reproducci贸n estacional en algunos mam铆feros. A nivel celular, la melatonina puede llevar a cabo sus efectos regulatorios a trav茅s de dos v铆as: bien por la uni贸n a receptores espec铆ficos de membrana, denominados MT1 y MT2, o bien atravesando directamente la membrana plasm谩tica. En el espermatozoide ovino se ha descrito que la melatonina modula la capacitaci贸n esperm谩tica (conjunto de cambios bioqu铆micos y biof铆sicos que necesita sufrir un espermatozoide para adquirir capacidad fecundante), de forma que a帽adida a concentraciones altas (1 M) tiene un efecto descapacitante. Dado que la enzima calcio-calmodulina prote铆n-kinasa II (CaMKII) tambi茅n est谩 implicada en la capacitaci贸n esperm谩tica, el objetivo principal de este trabajo fue evaluar el efecto de la melatonina, y de un agonista y un antagonista de los receptores de la misma, sobre la capacitaci贸n esperm谩tica y sobre los niveles y la activaci贸n por modificaciones postraduccionales de la CaMKII en espermatozoides ovinos. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 C, 5 % de CO2 y 100 % humedad) en medio TALP (control), en un medio con agentes elevadores del AMPc (cocktail), en medio cocktail con melatonina a una concentraci贸n 1 M, y con un agonista (8M-PDOT) o un antagonista (4P-PDOT) de los receptores de melatonina a帽adidos a diferentes concentraciones (1 M y 10 nM). Tras la incubaci贸n se evalu贸 la motilidad, viabilidad y estado de capacitaci贸n mediante tinci贸n con clorotetraciclina y fosforilaci贸n en residuos de tirosina evaluados por western-blot. El an谩lisis de los cambios en los niveles de CaMKII y su isoforma CaMKII伪 se realizaron mediante un inmunoensayo ELISA y la identificaci贸n y cuantificaci贸n de las modificaciones post-traduccionales en CaMKII se realiz贸 mediante western-blot. Los resultados obtenidos mostraron que la incubaci贸n con melatonina o su agonista a una concentraci贸n 1 M aument贸 el porcentaje de espermatozoides no capacitados (PEn conclusi贸n, este trabajo sugiere que la melatonina ejercer铆a su acci贸n descapacitante a trav茅s de la uni贸n a sus receptores de membrana, pero no modificar铆a los niveles o la activaci贸n de la enzima CaMKII por medio de modificaciones post-traduccionales, al menos mediante fosforilaci贸n.<br /
Efecto del fluido folicular en la quimiotaxis esperm谩tica ovina en funci贸n del momento del ciclo estral.
El fluido folicular conforma el entorno bioqu铆mico en el que se desarrolla el ovocito previo a su ovulaci贸n. Contiene hormonas, iones, metabolitos y factores de crecimiento entre otros muchos compuestos, cuya concentraci贸n var铆a a lo largo del ciclo reproductivo estral. Alguno de estos compuestos podr铆a estar involucrado en la respuesta quimiot谩ctica de los espermatozoides, mediante la cual ser铆an guiados hacia el ovocito para que se produzca la fecundaci贸n. Otro requisito fundamental para la fecundaci贸n es la capacitaci贸n, conjunto de cambios moleculares y bioqu铆micos que sufre el espermatozoide y le confieren capacidad fecundante.En estudios realizados en rat贸n y humano, se ha descrito que el fluido folicular ejerce una acci贸n quimioatrayente para los espermatozoides, pero hasta el momento no existe ning煤n estudio en la especie ovina. Por ello, el objetivo central de este trabajo consisti贸 en estudiar la capacidad quimiot谩ctica del fluido folicular de la oveja sobre los espermatozoides ovinos. Teniendo en cuenta la composici贸n variable de dicho fluido a lo largo del ciclo estral, se ensayaron fluidos foliculares obtenidos de dos momentos distintos del ciclo: en fase folicular temprana (proestro) y luteal temprana (metaestro), ambos a concentraciones de 2% y 10% (v/v). Dado que algunos estudios apuntan a que s贸lo los espermatozoides capacitados son capaces de responder ante un agente quimiot谩ctico, en este estudio se usaron tanto espermatozoides sin capacitar, como capacitados in vitro en presencia o ausencia de agentes elevadores de AMPc (cocktail y control, respectivamente). Tras la valoraci贸n previa del estado de los espermatozoides (motilidad, viabilidad y estado de capacitaci贸n), se realizaron los ensayos de quimiotaxis utilizando c谩maras IBIDI庐 碌-Slide Chemotaxis, y se analizaron mediante el software de acceso libre OpenCASA, que proporciona un valor de 铆ndice quimiot谩ctico.Los resultados obtenidos demuestran que el fluido folicular, tanto obtenido en fase folicular como luteal temprana, ejerce una acci贸n quimiot谩ctica a ambas concentraciones ensayadas, atrayendo hacia s铆, de una manera significativa, 煤nicamente a los espermatozoides capacitados in vitro. Se puede afirmar por ello, que el fluido folicular act煤a como quimioatrayente esperm谩tico en la especie ovina.Follicular fluid is the biochemical environment in which oocytes develop before ovulation. It contains hormones, ions, metabolites, growth factors and some other compounds which concentration vary along the oestral reproductive cycle. Some of these compounds may be involved in spermatic chemotactic response, which guides spermatozoa towards the oocyte for producing fertilization. Other main requierement for fertilization is capacitation, in which spermatozoa suffer molecular and biochemical changes necessary for acquire fertilizing ability.Follicular fluid has a chemotactic effect on mouse and human spermatozoa, but, so far, this effect has not been demonstrated in ram sperm. Thus, the main objective of this work was to evaluate the follicular fluid chemotactic effect on ram spermatozoa.The composition of follicular fluid varies along the reproductive cycle. Thus, we evaluated ewe follicular fluid obtained from two different stages of oestruscycle, early follicular phase (proestrus) and early luteal phase (metaestrus), both at 2% and 10% (v/v) concentrations. Previous studies had concluded that only capacitated spermatozoa show response towards chemotactic compounds, so in this study were used not only swim-up selected spermatozoa (non-capacitated), but also capacitated spermatozoa in vitro in the presence or absence of cAMP rising factors (named cocktail and control, respectively). After sperm evaluation (motility, viability and capacitation), chemotactic assays were performed in IBIDI庐 碌-Slide Chemotaxis chambers, and the results were analyzed by the OpenCASA software, that can calculate the chemotactic index.Our results demonstrate that both follicular fluids, obtained in early follicular phase and early luteal phase, produce a chemotactic response at both concentrations tested, only on in vitro capacitated spermatozoa. In conclusion, follicular fluid is a spermatic chemoattractant in sheep.<br /
Implementaci贸n e integraci贸n en OpenCASA de m贸dulos para estudios de acumulaci贸n y recuento celular
El grupo BIOFITER (Biolog铆a, Fisiolog铆a y Tecnolog铆as de la Reproducci贸n) de la Universidad de Zaragoza ha desarrollado recientemente OpenCASA, un software libre y abierto para el estudio de ciertas caracter铆sticas de los espermatozoides. En el presente trabajo se van a ampliar las funcionalidades de esta aplicaci贸n mediante el desarrollo de dos nuevos m贸dulos:1 - M贸dulo de estudio de la acumulaci贸n celular: permitir谩 proporcionar informaci贸n visual de la acumulaci贸n din谩mica de c茅lulas en torno a una sustancia quimioatrayente.2 - M贸dulo de recuento celular: proporciona el n煤mero de espermatozoides / mL de una muestra.<br /
Relaci贸n de la melatonina con el metabolismo del 贸xido n铆trico en espermatozoides ovinos
En la especie ovina la reproducci贸n tiene un car谩cter estacional muy marcado regulado por la secreci贸n de melatonina. Esta mol茅cula tiene, adem谩s, una gran capacidad antioxidante y es capaz de reducir, entre otras especies reactivas, los niveles de 贸xido n铆trico (NO). El NO se genera v铆a oxidaci贸n de L-arginina por la actividad de la 贸xido n铆trico sintasa o sintetasa (NOS). Existen tres isoformas de esta enzima: la neuronal (nNOS), la endotelial (eNOS) y la inducible (iNOS). En espermatozoides humanos se han identificado las tres isoformas de NOS y se ha demostrado que su actividad se incrementa a lo largo del proceso de capacitaci贸n in vitro. En espermatozoides ovinos, cuya capacitaci贸n in vitro resulta mucho m谩s complicada que en otras especies, no existen estudios que hayan identificado alguna de las isoformas de NOS. Por tanto, el objetivo de este Trabajo de Fin de Master es estudiar la acci贸n de la melatonina a diferentes concentraciones fisiol贸gicas, sobre los niveles de NO en espermatozoides ovinos incubados en condiciones capacitantes, identificar si las tres isoformas descritas de NOS est谩n presentes en espermatozoides ovinos y evaluar el efecto de la melatonina sobre estas isoformas de NOS. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 掳C y 5% de C02) en medio TALP (control), con alto cAMP (cocktail) y con dos concentraciones de melatonina (100 pM y 1 碌M) a帽adidas al medio cocktail, y se evaluaron los niveles de NO mediante citometr铆a de flujo. Para determinar si este efecto estaba mediado por la acci贸n de la 贸xido n铆trico sintasa, previamente se identificaron en espermatozoides ovinos las tres isoformas de la enzima descritas para otras especies, tras poner a punto los protocolos de western blot y de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Finalmente se evaluaron los cambios en la distribuci贸n de estas isoformas de NOS mediante IFI tras incubaci贸n de los espermatozoides en presencia de melatonina. Los resultados obtenidos indican que la melatonina, a concentraci贸n 1 碌M, es capaz de reducir significativamente los niveles de NO, los cuales se ven incrementados durante la capacitaci贸n esperm谩tica. Adem谩s se han identificado, por primera vez en el espermatozoide ovino, las tres isoformas de NOS, mediante western blot e inmunofluorescencia indirecta. La IFI tambi茅n revel贸 tres inmunotipos esperm谩ticos para cada una de las isoformas de NOS, cuyos porcentajes se modificaron durante la capacitaci贸n y el tratamiento con melatonina. As铆, la localizaci贸n en el borde apical de las isoformas eNOS e iNOS disminuye con la capacitaci贸n y la melatonina, a concentraci贸n 1 碌M y 100 pM, modifica el efecto producido por los agentes capacitantes sobre el porcentaje de los inmunotipos de la nNOS e iNOS, revirti茅ndolo en la primera y aument谩ndolo en la segunda. Por tanto, la melatonina durante la capacitaci贸n de los espermatozoides ovinos parece ejercer un papel antioxidante reduciendo los niveles de NO, posiblemente generado por las isoformas identificadas de la NOS. Adem谩s, el tratamiento con melatonina parece modificar la localizaci贸n de alguna de las isoformas de la NOS en el espermatozoide ovino
Efecto de la melatonina sobre la capacitaci贸n esperm谩tica en la especie ovina
La melatonina es una hormona importante en la regulaci贸n de la reproducci贸n, por lo que el descubrimiento de la presencia de los receptores de esta hormona en la superficie del espermatozoide ovino permite especular sobre su importancia en la funcionalidad esperm谩tica. Se sabe que, en ciertas c茅lulas som谩ticas, ejerce sus acciones a trav茅s de diversas v铆as moleculares, algunas implicadas en la regulaci贸n de procesos fisiol贸gicos del espermatozoide, como la capacitaci贸n. Esta capacitaci贸n es el conjunto de cambios moleculares y fisiol贸gicos que sufre el espermatozoide y que le confieren capacidad fecundante. Por otro lado, es sabido que la melatonina tiene la capacidad de reducir el estr茅s oxidativo inducido por especies reactivas de ox铆geno (ROS) y que durante la capacitaci贸n in vitro se produce un incremento de los niveles de ROS. Bas谩ndonos en estos datos, en el presente trabajo se plante贸 la hip贸tesis de que la melatonina jugar铆a un papel crucial en la capacitaci贸n esperm谩tica. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto de diferentes concentraciones de melatonina sobre distintos par谩metros relacionados con la funcionalidad esperm谩tica en muestras sometidas a capacitaci贸n in vitro. Los par谩metros analizados fueron la motilidad y la viabilidad celular y otros especialmente vinculados con la capacitaci贸n, como la hiperactivaci贸n, la distribuci贸n y la cantidad de calcio intracelular, los niveles de ROS, la cantidad de AMPc y los niveles de fosforilaci贸n en residuos de tirosina de las prote铆nas esperm谩ticas. Los resultados obtenidos en este trabajo indicaron que ninguna de las concentraciones de melatonina utilizadas (100 pM, 10 nM y 1 渭M) modificaron significativamente el porcentaje de espermatozoides m贸tiles o con membrana plasm谩tica 铆ntegra con respecto a las muestras capacitadas sin melatonina. Sin embargo, la presencia de 1 渭M de melatonina en el medio de capacitaci贸n dio lugar a un menor porcentaje de espermatozoides capacitados (p<0,001) junto con menores niveles de ROS y calcio intracelular y adem谩s menor grado de fosforilaci贸n en residuos de tirosinas. En conclusi贸n, en este estudio se demostr贸 que la melatonina tiene efectos directos sobre la capacitaci贸n del espermatozoide ovino
Efecto de la melatonina sobre la Ca2+/Calmodulina prote铆n-kinasa II de los espermatozoides ovinos
La melatonina es una hormona que se sintetiza principalmente en la gl谩ndula pineal y que regula muchos procesos fisiol贸gicos, como la reproducci贸n estacional. A nivel celular es capaz de aumentar los niveles de calcio intracelular en c茅lulas som谩ticas y unirse a la prote铆na calmodulina. Esto inhibe la formaci贸n del complejo calcio/calmodulina, que regula la actividad de la enzima calcio/calmodulina prote铆n-quinasa II (CaMKII). Dado que tanto el aumento de los niveles de calcio como la actividad de CaMKII est谩n implicados en la capacitaci贸n esperm谩tica (conjunto de cambios que debe sufrir un espermatozoide para adquirir capacidad fecundante), en el presente trabajo se plante贸 la hip贸tesis de que la melatonina podr铆a modular la capacitaci贸n esperm谩tica ovina a trav茅s de la enzima CaMKII. As铆, los objetivos de este estudio fueron investigar el efecto de la melatonina sobre los niveles y distribuci贸n del calcio intracelular, identificar la presencia de la prote铆na CaMKII en el espermatozoide ovino y evaluar los cambios en la concentraci贸n de la misma en espermatozoides ovinos incubados en condiciones capacitantes. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 掳C y 5% de CO2) en medio TALP (control), y con dos concentraciones de melatonina (100 pM y 1 碌M). Tras la incubaci贸n se evalu贸 la motilidad, viabilidad, y estado de capacitaci贸n de las muestras. Los cambios en la concentraci贸n y distribuci贸n de calcio intracelular se evaluaron mediante citometr铆a de flujo con las sondas Fluo-4 AM y Rhod-5N AM. Finalmente, la identificaci贸n y cuantificaci贸n de CaMKII se realiz贸 mediante Western Blot en prote铆nas esperm谩ticas extra铆das tras la capacitaci贸n in vitro. Los resultados obtenidos indican que la melatonina a una concentraci贸n 1 碌M es capaz de aumentar el porcentaje de espermatozoides vivos con altos niveles de calcio tras tres horas de incubaci贸n en condiciones capacitantes, sin afectar negativamente a la funcionalidad esperm谩tica. Adem谩s, la presencia de melatonina en el medio parece aumentar los niveles de CaMKII y de una de sus isoformas (CaMKII伪) en el espermatozoide de morueco. En conclusi贸n, este trabajo sugiere que la melatonina podr铆a regular el proceso de capacitaci贸n esperm谩tica aumentando los niveles de la enzima CaMKII, aunque las implicaciones que puede tener esto en su activaci贸n o actividad todav铆a no est谩n esclarecidas