Understanding sperm quality for improved reproductive performance

The assessment of semen quality is used to identify factors that influence sperm performance and diagnose male infertility [...

Estudio de la influencia de la progesterona sobre la selección espermática

La progesterona (PG) es una hormona fundamental en la reproducción de los mamíferos que regula la expresión génica del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal por medio de receptores nucleares. Está presente en el tracto reproductor femenino, y dado que, el espermatozoide presenta receptores para esta hormona en la membrana plasmática, se ha especulado que la PG además, podría regular la funcionalidad espermática por medio de rápidas acciones no genómicas. Entre estas acciones podría incluirse el control de la capacitación, que es el conjunto de cambios que sufre el espermatozoide en el tracto reproductor femenino y que le confieren capacidad fecundante. Asimismo, también podría influir en la capacidad de guiar al espermatozoide hacia el ovocito, esencial para el éxito de la fecundación. Hasta la fecha no hay estudios sobre el efecto de la PG en la funcionalidad y en la orientación espermática en la especie ovina. En consecuencia, el objetivo principal de este trabajo fue analizar el efecto de la PG sobre los espermatozoides ovinos, determinando su influencia en la funcionalidad espermática y su capacidad quimioatrayente. Para ello, se realizó un proceso de selección espermática in vitro mediante la técnica de swim-up/dextrano añadiendo PG a dosis 100 pM o 1 µM en la capa superior de recogida y evaluando posteriormente el porcentaje de recuperación celular y la funcionalidad de los espermatozoides recuperados. Asimismo, se analizó la capacidad quimiotáctica de la PG, tanto en espermatozoides frescos como sometidos a un proceso de capacitación in vitro, utilizando una cámara de análisis de quimiotaxis y un software experimental desarrollado por el grupo. Ambas dosis de PG ensayadas dieron lugar a un incremento estadísticamente significativo del porcentaje de recuperación celular y de espermatozoides capacitados respecto al control, si bien no tuvieron efecto en la motilidad, en el estado de la membrana plasmática (integridad de la misma y exposición de fosfadidilserina) y la distribución del receptor de la PG en la superficie de los espermatozoides recuperados. Además, se demostró la capacidad quimiotáctica de la PG sobre espermatozoides ovinos capacitados in vitro

Estudio de la posible acción protectora de la melatonina frente al daño por frío en espermatozoides ovinos

Las dosis seminales ovinas se suelen refrigerar para su uso a corto plazo en inseminación artificial. Los espermatozoides de la especie ovina son especialmente susceptibles al frío, y su exposición a bajas temperaturas produce una serie de cambios entre los que se incluyen pérdida de motilidad, de integridad de membrana, aumento de marcadores apoptóticos y una capacitación prematura o criocapacitación. La capacitación es un proceso complejo por el cual los espermatozoides adquieren capacidad fecundante, pero si esta se produce lejos del ovocito, el espermatozoide no será capaz de cumplir su misión, por lo que una capacitación prematura consecuencia del frío resulta indeseable. La melatonina es una hormona importante en la regulación de la reproducción. El descubrimiento de la presencia de receptores para esta hormona en la superficie del espermatozoide ovino, indicaría una acción directa de la misma sobre la funcionalidad de estas células. Algunas de las rutas moleculares a través de las que actúa la melatonina en algunas células somáticas también están implicadas en la regulación de procesos fisiológicos del espermatozoide, como la capacitación. Además, también se atribuye un papel protector frente a la apoptosis en algunos tipos celulares. Por ello, en el presente trabajo se planteó la hipótesis de que la melatonina podría tener un efecto de protección frente al frío en espermatozoides, evitando los cambios relacionados con la criocapacitación y el aumento de marcadores apoptóticos. El objetivo de este estudio fue estudiar el efecto de diferentes concentraciones de melatonina añadidas a los espermatozoides antes de ser sometidos a bajas temperaturas, analizando distintos parámetros relacionados con la funcionalidad espermática: motilidad, integridad de membrana, estado de capacitación (relacionado con la distribución del calcio intracelular y la fosforilación de tirosinas de proteínas de membrana) y marcadores apoptóticos. Los resultados obtenidos indican que la refrigeración directa a 5 ºC, aunque no afecta a la motilidad espermática, produce efectos subletales sobre los espermatozoides reflejándose en una disminución importante del resto de parámetros de calidad seminal. Las dosis de melatonina utilizadas (100 pM, 10 nM y 1 μM) no mejoran de manera significativa los valores de motilidad e integridad de membrana, pero sí disminuye significativamente el porcentaje de espermatozoides capacitados si se incuba la muestra con las dosis de 100 pM y 10 nM previamente a la refrigeración. La melatonina, a dosis bajas (100 pM), disminuye el porcentaje de espermatozoides con marcadores apoptóticos como la inversión de fosfatidilserina y la actividad de caspasas, si bien este descenso no es significativo. En conclusión, en este estudio se demuestra que la melatonina es capaz de evitar, al menos parcialmente, la capacitación prematura asociada a frío

In vitro approach points to a chemotactic effect of melatonin on ram spermatozoa

Sperm orientation mechanisms, such as chemotaxis, are essential for the sperm to reach the oocyte and fertilize it. Melatonin is secreted by the cumulus cells and is also present in the follicular fluid in mammals. The presence of membrane receptors for melatonin in ram spermatozoa, and its proven involvement in the sperm functionality, may suggest a possible role in the guided movement towards the oocyte. Hence, the objective of the present work is to study the in vitro potential chemotactic action of melatonin on ram spermatozoa, analysing the influence of the season (breeding and non-breeding) and the sperm capacitation state. The first experimental approach consisted in the inclusion of melatonin in the upper layer of a swim-up selection method. During the non-breeding season, the presence of melatonin at 100 pM and 1 μM concentrations significantly increased the cell recovery rate, and induced changes in the sperm location of the MT2 melatonin receptor, compared with the standard swim-up. Moreover, the selected sperm population with 100 pM melatonin presented a higher percentage of capacitated spermatozoa. The greater recovery rate obtained with melatonin could be due to the stimulation of sperm movement in random directions, i.e., a chemokinetic effect, or due to a guided movement (chemotaxis) towards the gradient of the melatonin. To elucidate this issue, together with the study of the influence of the sperm capacitation status, we performed a second experimental approach which consisted in the use of chemotaxis chambers and an open-source software (Open-CASA) that analyses the sperm trajectories towards the hormone gradient and calculates a chemotaxis index (SL index). There was a significant difference between the SL index in the presence of 1 μM melatonin and the control without hormone. This effect was only observed in capacitated spermatozoa with cAMP-elevating agents (Cap-CK samples) obtained during the non-breeding season. These results would point to an in vitro chemotactic effect of melatonin on ram spermatozoa, although chemokinesis cannot be ruled out. Nonetheless, the inclusion of this hormone in the swim-up procedure could enhance the sperm recovery rate

Estudio de las rutas moleculares implicadas en la acción de la melatonina sobre la calcio-calmodulina kinasa II de los espermatozoides

La melatonina es una hormona sintetizada principalmente en la glándula pineal que está implicada en la regulación de muchos procesos biológicos, entre los que se encuentra la reproducción estacional en algunos mamíferos. A nivel celular, la melatonina puede llevar a cabo sus efectos regulatorios a través de dos vías: bien por la unión a receptores específicos de membrana, denominados MT1 y MT2, o bien atravesando directamente la membrana plasmática. En el espermatozoide ovino se ha descrito que la melatonina modula la capacitación espermática (conjunto de cambios bioquímicos y biofísicos que necesita sufrir un espermatozoide para adquirir capacidad fecundante), de forma que añadida a concentraciones altas (1 M) tiene un efecto descapacitante. Dado que la enzima calcio-calmodulina proteín-kinasa II (CaMKII) también está implicada en la capacitación espermática, el objetivo principal de este trabajo fue evaluar el efecto de la melatonina, y de un agonista y un antagonista de los receptores de la misma, sobre la capacitación espermática y sobre los niveles y la activación por modificaciones postraduccionales de la CaMKII en espermatozoides ovinos. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 C, 5 % de CO2 y 100 % humedad) en medio TALP (control), en un medio con agentes elevadores del AMPc (cocktail), en medio cocktail con melatonina a una concentración 1 M, y con un agonista (8M-PDOT) o un antagonista (4P-PDOT) de los receptores de melatonina añadidos a diferentes concentraciones (1 M y 10 nM). Tras la incubación se evaluó la motilidad, viabilidad y estado de capacitación mediante tinción con clorotetraciclina y fosforilación en residuos de tirosina evaluados por western-blot. El análisis de los cambios en los niveles de CaMKII y su isoforma CaMKIIα se realizaron mediante un inmunoensayo ELISA y la identificación y cuantificación de las modificaciones post-traduccionales en CaMKII se realizó mediante western-blot. Los resultados obtenidos mostraron que la incubación con melatonina o su agonista a una concentración 1 M aumentó el porcentaje de espermatozoides no capacitados (PEn conclusión, este trabajo sugiere que la melatonina ejercería su acción descapacitante a través de la unión a sus receptores de membrana, pero no modificaría los niveles o la activación de la enzima CaMKII por medio de modificaciones post-traduccionales, al menos mediante fosforilación.<br /

Efecto del fluido folicular en la quimiotaxis espermática ovina en función del momento del ciclo estral.

El fluido folicular conforma el entorno bioquímico en el que se desarrolla el ovocito previo a su ovulación. Contiene hormonas, iones, metabolitos y factores de crecimiento entre otros muchos compuestos, cuya concentración varía a lo largo del ciclo reproductivo estral. Alguno de estos compuestos podría estar involucrado en la respuesta quimiotáctica de los espermatozoides, mediante la cual serían guiados hacia el ovocito para que se produzca la fecundación. Otro requisito fundamental para la fecundación es la capacitación, conjunto de cambios moleculares y bioquímicos que sufre el espermatozoide y le confieren capacidad fecundante.En estudios realizados en ratón y humano, se ha descrito que el fluido folicular ejerce una acción quimioatrayente para los espermatozoides, pero hasta el momento no existe ningún estudio en la especie ovina. Por ello, el objetivo central de este trabajo consistió en estudiar la capacidad quimiotáctica del fluido folicular de la oveja sobre los espermatozoides ovinos. Teniendo en cuenta la composición variable de dicho fluido a lo largo del ciclo estral, se ensayaron fluidos foliculares obtenidos de dos momentos distintos del ciclo: en fase folicular temprana (proestro) y luteal temprana (metaestro), ambos a concentraciones de 2% y 10% (v/v). Dado que algunos estudios apuntan a que sólo los espermatozoides capacitados son capaces de responder ante un agente quimiotáctico, en este estudio se usaron tanto espermatozoides sin capacitar, como capacitados in vitro en presencia o ausencia de agentes elevadores de AMPc (cocktail y control, respectivamente). Tras la valoración previa del estado de los espermatozoides (motilidad, viabilidad y estado de capacitación), se realizaron los ensayos de quimiotaxis utilizando cámaras IBIDI® µ-Slide Chemotaxis, y se analizaron mediante el software de acceso libre OpenCASA, que proporciona un valor de índice quimiotáctico.Los resultados obtenidos demuestran que el fluido folicular, tanto obtenido en fase folicular como luteal temprana, ejerce una acción quimiotáctica a ambas concentraciones ensayadas, atrayendo hacia sí, de una manera significativa, únicamente a los espermatozoides capacitados in vitro. Se puede afirmar por ello, que el fluido folicular actúa como quimioatrayente espermático en la especie ovina.Follicular fluid is the biochemical environment in which oocytes develop before ovulation. It contains hormones, ions, metabolites, growth factors and some other compounds which concentration vary along the oestral reproductive cycle. Some of these compounds may be involved in spermatic chemotactic response, which guides spermatozoa towards the oocyte for producing fertilization. Other main requierement for fertilization is capacitation, in which spermatozoa suffer molecular and biochemical changes necessary for acquire fertilizing ability.Follicular fluid has a chemotactic effect on mouse and human spermatozoa, but, so far, this effect has not been demonstrated in ram sperm. Thus, the main objective of this work was to evaluate the follicular fluid chemotactic effect on ram spermatozoa.The composition of follicular fluid varies along the reproductive cycle. Thus, we evaluated ewe follicular fluid obtained from two different stages of oestruscycle, early follicular phase (proestrus) and early luteal phase (metaestrus), both at 2% and 10% (v/v) concentrations. Previous studies had concluded that only capacitated spermatozoa show response towards chemotactic compounds, so in this study were used not only swim-up selected spermatozoa (non-capacitated), but also capacitated spermatozoa in vitro in the presence or absence of cAMP rising factors (named cocktail and control, respectively). After sperm evaluation (motility, viability and capacitation), chemotactic assays were performed in IBIDI® µ-Slide Chemotaxis chambers, and the results were analyzed by the OpenCASA software, that can calculate the chemotactic index.Our results demonstrate that both follicular fluids, obtained in early follicular phase and early luteal phase, produce a chemotactic response at both concentrations tested, only on in vitro capacitated spermatozoa. In conclusion, follicular fluid is a spermatic chemoattractant in sheep.<br /

Implementación e integración en OpenCASA de módulos para estudios de acumulación y recuento celular

El grupo BIOFITER (Biología, Fisiología y Tecnologías de la Reproducción) de la Universidad de Zaragoza ha desarrollado recientemente OpenCASA, un software libre y abierto para el estudio de ciertas características de los espermatozoides. En el presente trabajo se van a ampliar las funcionalidades de esta aplicación mediante el desarrollo de dos nuevos módulos:1 - Módulo de estudio de la acumulación celular: permitirá proporcionar información visual de la acumulación dinámica de células en torno a una sustancia quimioatrayente.2 - Módulo de recuento celular: proporciona el número de espermatozoides / mL de una muestra.<br /

Relación de la melatonina con el metabolismo del óxido nítrico en espermatozoides ovinos

En la especie ovina la reproducción tiene un carácter estacional muy marcado regulado por la secreción de melatonina. Esta molécula tiene, además, una gran capacidad antioxidante y es capaz de reducir, entre otras especies reactivas, los niveles de óxido nítrico (NO). El NO se genera vía oxidación de L-arginina por la actividad de la óxido nítrico sintasa o sintetasa (NOS). Existen tres isoformas de esta enzima: la neuronal (nNOS), la endotelial (eNOS) y la inducible (iNOS). En espermatozoides humanos se han identificado las tres isoformas de NOS y se ha demostrado que su actividad se incrementa a lo largo del proceso de capacitación in vitro. En espermatozoides ovinos, cuya capacitación in vitro resulta mucho más complicada que en otras especies, no existen estudios que hayan identificado alguna de las isoformas de NOS. Por tanto, el objetivo de este Trabajo de Fin de Master es estudiar la acción de la melatonina a diferentes concentraciones fisiológicas, sobre los niveles de NO en espermatozoides ovinos incubados en condiciones capacitantes, identificar si las tres isoformas descritas de NOS están presentes en espermatozoides ovinos y evaluar el efecto de la melatonina sobre estas isoformas de NOS. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 °C y 5% de C02) en medio TALP (control), con alto cAMP (cocktail) y con dos concentraciones de melatonina (100 pM y 1 µM) añadidas al medio cocktail, y se evaluaron los niveles de NO mediante citometría de flujo. Para determinar si este efecto estaba mediado por la acción de la óxido nítrico sintasa, previamente se identificaron en espermatozoides ovinos las tres isoformas de la enzima descritas para otras especies, tras poner a punto los protocolos de western blot y de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Finalmente se evaluaron los cambios en la distribución de estas isoformas de NOS mediante IFI tras incubación de los espermatozoides en presencia de melatonina. Los resultados obtenidos indican que la melatonina, a concentración 1 µM, es capaz de reducir significativamente los niveles de NO, los cuales se ven incrementados durante la capacitación espermática. Además se han identificado, por primera vez en el espermatozoide ovino, las tres isoformas de NOS, mediante western blot e inmunofluorescencia indirecta. La IFI también reveló tres inmunotipos espermáticos para cada una de las isoformas de NOS, cuyos porcentajes se modificaron durante la capacitación y el tratamiento con melatonina. Así, la localización en el borde apical de las isoformas eNOS e iNOS disminuye con la capacitación y la melatonina, a concentración 1 µM y 100 pM, modifica el efecto producido por los agentes capacitantes sobre el porcentaje de los inmunotipos de la nNOS e iNOS, revirtiéndolo en la primera y aumentándolo en la segunda. Por tanto, la melatonina durante la capacitación de los espermatozoides ovinos parece ejercer un papel antioxidante reduciendo los niveles de NO, posiblemente generado por las isoformas identificadas de la NOS. Además, el tratamiento con melatonina parece modificar la localización de alguna de las isoformas de la NOS en el espermatozoide ovino

Efecto de la melatonina sobre la Ca2+/Calmodulina proteín-kinasa II de los espermatozoides ovinos

La melatonina es una hormona que se sintetiza principalmente en la glándula pineal y que regula muchos procesos fisiológicos, como la reproducción estacional. A nivel celular es capaz de aumentar los niveles de calcio intracelular en células somáticas y unirse a la proteína calmodulina. Esto inhibe la formación del complejo calcio/calmodulina, que regula la actividad de la enzima calcio/calmodulina proteín-quinasa II (CaMKII). Dado que tanto el aumento de los niveles de calcio como la actividad de CaMKII están implicados en la capacitación espermática (conjunto de cambios que debe sufrir un espermatozoide para adquirir capacidad fecundante), en el presente trabajo se planteó la hipótesis de que la melatonina podría modular la capacitación espermática ovina a través de la enzima CaMKII. Así, los objetivos de este estudio fueron investigar el efecto de la melatonina sobre los niveles y distribución del calcio intracelular, identificar la presencia de la proteína CaMKII en el espermatozoide ovino y evaluar los cambios en la concentración de la misma en espermatozoides ovinos incubados en condiciones capacitantes. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 °C y 5% de CO2) en medio TALP (control), y con dos concentraciones de melatonina (100 pM y 1 µM). Tras la incubación se evaluó la motilidad, viabilidad, y estado de capacitación de las muestras. Los cambios en la concentración y distribución de calcio intracelular se evaluaron mediante citometría de flujo con las sondas Fluo-4 AM y Rhod-5N AM. Finalmente, la identificación y cuantificación de CaMKII se realizó mediante Western Blot en proteínas espermáticas extraídas tras la capacitación in vitro. Los resultados obtenidos indican que la melatonina a una concentración 1 µM es capaz de aumentar el porcentaje de espermatozoides vivos con altos niveles de calcio tras tres horas de incubación en condiciones capacitantes, sin afectar negativamente a la funcionalidad espermática. Además, la presencia de melatonina en el medio parece aumentar los niveles de CaMKII y de una de sus isoformas (CaMKIIα) en el espermatozoide de morueco. En conclusión, este trabajo sugiere que la melatonina podría regular el proceso de capacitación espermática aumentando los niveles de la enzima CaMKII, aunque las implicaciones que puede tener esto en su activación o actividad todavía no están esclarecidas

Efecto de la melatonina sobre la capacitación espermática en la especie ovina

La melatonina es una hormona importante en la regulación de la reproducción, por lo que el descubrimiento de la presencia de los receptores de esta hormona en la superficie del espermatozoide ovino permite especular sobre su importancia en la funcionalidad espermática. Se sabe que, en ciertas células somáticas, ejerce sus acciones a través de diversas vías moleculares, algunas implicadas en la regulación de procesos fisiológicos del espermatozoide, como la capacitación. Esta capacitación es el conjunto de cambios moleculares y fisiológicos que sufre el espermatozoide y que le confieren capacidad fecundante. Por otro lado, es sabido que la melatonina tiene la capacidad de reducir el estrés oxidativo inducido por especies reactivas de oxígeno (ROS) y que durante la capacitación in vitro se produce un incremento de los niveles de ROS. Basándonos en estos datos, en el presente trabajo se planteó la hipótesis de que la melatonina jugaría un papel crucial en la capacitación espermática. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto de diferentes concentraciones de melatonina sobre distintos parámetros relacionados con la funcionalidad espermática en muestras sometidas a capacitación in vitro. Los parámetros analizados fueron la motilidad y la viabilidad celular y otros especialmente vinculados con la capacitación, como la hiperactivación, la distribución y la cantidad de calcio intracelular, los niveles de ROS, la cantidad de AMPc y los niveles de fosforilación en residuos de tirosina de las proteínas espermáticas. Los resultados obtenidos en este trabajo indicaron que ninguna de las concentraciones de melatonina utilizadas (100 pM, 10 nM y 1 μM) modificaron significativamente el porcentaje de espermatozoides mótiles o con membrana plasmática íntegra con respecto a las muestras capacitadas sin melatonina. Sin embargo, la presencia de 1 μM de melatonina en el medio de capacitación dio lugar a un menor porcentaje de espermatozoides capacitados (p<0,001) junto con menores niveles de ROS y calcio intracelular y además menor grado de fosforilación en residuos de tirosinas. En conclusión, en este estudio se demostró que la melatonina tiene efectos directos sobre la capacitación del espermatozoide ovino