LIM-proteiini CRP1

Various intrinsic and external factors are constantly attacking the cells causing damage to DNA and to other cellular structures. Cells in turn have evolved with different kinds of mechanisms to protect against the attacks and to repair the damage. Ultraviolet radiation (UVR) is one of the major environmental genotoxic carcinogens that causes inflammation, mutations, immunosuppression, accelerated aging of the skin and skin cancers. Epidermis is the outermost layer of the skin consisting mostly of keratinocytes, whose primary function is to protect the skin against e.g. UV radiation. LIM domain proteins are a group of proteins involved in regulation of cell growth, damage signalling, cell fate determination and signal transduction. Despite their two zinc fingers, LIM domains do not bind to DNA, but rather mediate protein-protein interactions and function as modular protein binding interfaces. We initially identified CSRP1 as UVR-regulated transcript by using expression profiling. Here we have further studied the regulation and function of CRP1, a representative of cysteine rich protein- family consisting of two LIM domains. We find that CRP1 is increased by UVR in primary human keratinocytes and in normal human skin fibroblasts. Ectopic expression of CRP1 protected the cells against UVR and provided a survival advantage, whereas silencing of CRP1 rendered the cells more photosensitive. Actinic keratosis is a premalignant lesion of skin caused by excess exposure to sunlight and sunburn, which may lead to formation of squamous cell carcinoma. The expression of CRP1 was increased in basal keratinocytes of Actinic keratosis patient specimens suggesting that CRP1 may be increased by constant exposure to UVR and may provide survival advantage for the cells also in vivo. In squamous cell carcinoma, CRP1 was only expressed in the fibroblasts surrounding the tumour. Moreover, we found that ectopic expression of CRP1 suppresses cell proliferation. Transforming growth factor beta (TGFbeta) is a multifunctional cytokine that regulates several functions in cell including growth, apoptosis and differentiation, and plays important roles in pathological disorders like cancer and fibrosis. We found that TGFbeta-signalling pathway regulates CRP1 at protein, but not at transcriptional level. The increase was mediated both through Smad and non-Smad signalling pathways involving MAPK/p38. Furthermore, we found that TGFbeta-mediated increase in CRP1 was associated with myofibroblast differentiation, and that CRP1 was significantly more expressed in idiopathic pulmonary fibrosis as compared to normal lung specimens. Since cell contractility is a distinct feature of myofibroblasts, and CRP1 is associated with actin cytoskeleton, we studied the role of CRP1 in cell contractility. CRP1 was found to localize to stress fibres that mediate contractility and to mediate myofibroblast contraction. These studies identify CRP1 as a stress responsive and cytokine regulated cytoskeletal protein that participates in pathological processes involved in fibrotic diseases and cancer.Solu ja sen DNA ovat jatkuvasti alttiina vaurioittaville tekijöille, ja solu on kehittänyt erilaisia tapoja puolustautuakseen niitä vastaan. Ultraviolettisäteily on yksi ympäristön yleisimmistä karsinogeeneistä, joka aiheuttaa mutaatioita, ihon nopeutunutta ikääntymistä ja ihosyöpiä. Orvaskesi on ihon uloin osa, joka koostuu pääosin keratinosyyteistä, ja niiden tehtävänä on suojata ihoa mm. ultraviolettisäteilyä vastaan. LIM-proteiinit toimivat useissa eri tehtävissä solussa, ja ovat osallisena mm. solun kasvussa, vauriosignaloinnissa, stressivasteessa ja signaalinvälityksessä. Vaikka näitä proteiineja yhdistääkin sinkkisormi -rakenne, ne eivät kykene sitoutumaan DNA:han, vaan toimivat proteiini-proteiini-interaktioiden kautta. Tutkimamme LIM-proteiini, CRP1, tuli alunperin esiin geenisirututkimuksessamme, jonka tarkoituksena oli etsiä aiemmin tuntemattomia ultraviolettisäteilyn säätelemiä geenejä. Tutkimuksissamme tuli esiin, että ultraviolettisäteily lisäsi CRP1-proteiinin määrää. CRP1:n ylituottaminen soluissa tarjosi soluille suojan säteilyä ja solukuolemaa vastaan, kun taas CRP1:n hiljentäminen johti lisääntyneeseen ultraviolettisäteilyn aiheuttamaan solukuolemaan. Koska ihon keratinosyytit ovat ensisijainen kohde ultraviolettisäteilyn aiheuttamille vaurioille, tutkimme CRP1:n ilmentymistä ihmisen primaareissa keratinosyyteissä ja huomasimme, että ultraviolettisäteily nostaa CRP1:n määrää myös niissä. Aktiininen keratoosi on auringon aiheuttama ihosairaus, joka voi johtaa ihon okasolusyövän syntyyn. Tutkimme CRP1:n ilmentymistä potilaista eristetyistä näytteistä, ja huomasimme CRP1-proteiinin tasojen nousseen aktiinisessa keratoosissa keratinosyyteissä, mikä saattaa olla merkkinä siitä, että CRP1-proteiinin määrä nousee ultraviolettisäteilyn myötä ja tarjoaa soluille selviytymisedun solukuolemaa vastaan myös kudoksissa. Okasolusyöpänäytteissä CRP1 ilmentyi lähinnä kasvainta ympäröivissä fibroblasteissa. Transformoiva kasvutekijä beta (TGFbeta) säätelee kasvua, apoptoosia ja erilaistumista, ja vaikuttaa fibroosin ja syövän kehittymiseen. Tutkimuksissamme kävi ilmi, että TGFbeta säätelee CRP1:n ilmentymistä soluissa, ja tämä säätely liittyi myofibroblastien erilaistumiseen. Koska myofibroblasteilla on erityisesti merkitystä fibroottisissa taudeissa, tutkimme CRP1:n ilmentymistä idiopaattisessa keuhkofibroosissa. CRP1:n määrä oli merkittävästi kohonnut IPF-potilaiden keuhkoista eristetyissä näytteissä. Lisäksi myofibroblastien supistumiskyvyllä on taudin kannalta merkittävä osuus, ja tutkimuksemme osoittavat CRP1:n vaikuttavan solun supistumiskykyyn. Kokonaisuutena tutkimuksemme on tuonut tietoa miten CRP1 proteiini toimii solujen vaurio- ja stressivasteissa

Assessment of In-House Natural Product and Synthetic Compound Libraries Based on In vitro Inhibition of Cholinesterases

The first line medication for mild to moderate Alzheimer s disease (AD) is based on cholinesterase inhibitors which prolong the effect of the neurotransmitter acetylcholine in cholinergic nerve synapses which relieves the symptoms of the disease. Implications of cholinesterases involvement in disease modifying processes has increased interest in this research area. The drug discovery and development process is a long and expensive process that takes on average 13.5 years and costs approximately 0.9 billion US dollars. Drug attritions in the clinical phases are common due to several reasons, e.g., poor bioavailability of compounds leading to low efficacy or toxic effects. Thus, improvements in the early drug discovery process are needed to create highly potent non-toxic compounds with predicted drug-like properties. Nature has been a good source for the discovery of new medicines accounting for around half of the new drugs approved to market during the last three decades. These compounds are direct isolates from the nature, their synthetic derivatives or natural mimics. Synthetic chemistry is an alternative way to produce compounds for drug discovery purposes. Both sources have pros and cons. The screening of new bioactive compounds in vitro is based on assaying compound libraries against targets. Assay set-up has to be adapted and validated for each screen to produce high quality data. Depending on the size of the library, miniaturization and automation are often requirements to reduce solvent and compound amounts and fasten the process. In this contribution, natural extract, natural pure compound and synthetic compound libraries were assessed as sources for new bioactive compounds. The libraries were screened primarily for acetylcholinesterase inhibitory effect and secondarily for butyrylcholinesterase inhibitory effect. To be able to screen the libraries, two assays were evaluated as screening tools and adapted to be compatible with special features of each library. The assays were validated to create high quality data. Cholinesterase inhibitors with various potencies and selectivity were found in natural product and synthetic compound libraries which indicates that the two sources complement each other. It is acknowledged that natural compounds differ structurally from compounds in synthetic compound libraries which further support the view of complementation especially if a high diversity of structures is the criterion for selection of compounds in a library.Koliiniesteraasien estäjiä käytetään lievän tai keskivaikean Alzheimerin taudin ensisijaisena lääkehoitona. Koliiniesteraasien estäjät pidentävät asetyylikoliini-hermovälittäjäaineen vaikutusta hermosynapseissa, mikä johtaa Alzheimerin taudin oireiden lievenemiseen. Viitteet koliiniesteraasien estäjien mahdollisista vaikutuksista myös taudin etenemiseen ovat lisänneet kiinnostusta tätä tutkimusalaa kohtaan. Lääkkeen keksimis- ja kehittämisprosessi on aikaa vievää ja kallista. Keskimäärin aikaa kuluu 13,5 vuotta ja koko prosessi maksaa noin 0,9 miljardia Yhdysvaltain dollaria. Lääkekandidaatin hylkääminen kesken kliinisten kokeiden on yleistä. Syitä hylkäämiseen on useita esim. huono biologinen hyötyosuus, mikä voi johtaa muun muassa heikkoon tehoon. Lääkkeenkeksimisprosessin alkuvaiheiden kehittäminen parantaa mahdollisuuksia löytää tehokkaita ja turvallisia lääkkeenkaltaisia yhdisteitä. Lääkkeenkaltaisten yhdisteiden etuna on se, että niiden käyttäytyminen on ennustettavissa siirryttäessä lääkkeenkeksimisvaiheesta eteenpäin lääkekehitykseen. Luonto on ollut hyvä lähde uusien lääkeaineiden etsimisessä. Noin puolet viimeisten kolmen vuosikymmenen aikana markkinoille hyväksytyistä lääkeaineista on peräisin luonnosta. Nämä yhdisteet on joko eristetty suoraan luonnosta, ne ovat luonnonaineiden synteettisiä johdoksia tai rakenne on muuten matkittu luonnosta peräisin olevista yhdisteistä. Toinen tapa tuottaa uusia molekyylejä lääkkeenkeksimisprosessia varten on synteettisen kemian hyödyntäminen. Näissä molemmissa lähestymistavoissa on omat hyvät ja huonot puolensa. Uusien lääkeainekandidaattien seulominen in vitro perustuu siihen, että kohde, joka tässä työssä oli proteiini, altistetaan kirjastoissa oleville näytteille ja mitataan muuttuuko kohteen toiminta. Koejärjestely täytyy validoida seulontaa varten, jotta seulonnan tulokset ovat laadukkaita ja luotettavia. Kun seulotaan tuhansia näytteitä, on kokeen miniatyrisoiminen ja automatisoiminen välttämätöntä liuosten ja tutkittavien yhdisteiden kulutuksen vähentämiseksi sekä prosessin nopeuttamiseksi. Tässä työssä tutkittiin näytekirjastoja, jotka sisälsivät luonnosta peräisin olevia uutteita ja puhdasaineita tai synteettisiä yhdisteitä. Näytekirjastoista seulottiin yhdisteitä, jotka estävät ensisijaisesti asetyylikoliiniesteraasia ja toissijaisesti butyryylikoliiniesteraasia. Työssä arvioitiin myös kahden kokeen toimivuutta ja käyttökelpoisuutta seulonnassa. Lisäksi kokeet muokattiin sopimaan monentyyppisten näytekirjastojen seulontaan, koska uutekirjastojen ja puhdasainekirjastojen ominaisuudet asettavat erilaisia haasteita koejärjestelyille. Kokeiden validoinnilla varmistettiin, että seulonnassa saatavista tuloksista tulee luotettavia. Työssä löydettiin useita koliiniesteraasien estäjiä, joiden estovaikutukset erosivat toisistaan selektiivisyyden ja tehon osalta. Uusia koliiniesteraasien estäjiä löytyi sekä luonnonkirjastoista että synteettisestä kirjastosta, mikä osoittaa näiden lähteiden täydentävän toisiaan lääkkeenkeksimisprosessissa. On yleisesti tiedossa, että luonnosta peräisin olevat yhdisteet eroavat rakenteellisesti synteettisten näytekirjastojen yhdisteistä. Molempia lähteitä kannattaa hyödyntää lääkkeenkeksimisprosessissa, erityisesti rakenteellisen monimuotoisuuden ollessa seulontaan valittavien yhdisteiden kriteeri

Simultaneous Culturing of Cell Monolayers and Spheroids on a Single Microfluidic Device for Bridging the Gap between 2D and 3D Cell Assays in Drug Research

Two‐dimensional (2D) cell cultures have been the primary screening tools to predict drug impacts in vitro for decades. However, owing to the lack of tissue‐specific architecture of 2D cultures, secondary screening using three‐dimensional (3D) cell culture models is often necessary. A microfluidic approach that facilitates side‐by‐side 2D and 3D cell culturing in a single microchannel and thus combines the benefits of both set‐ups in drug screening; that is, the uniform spatiotemporal distributions of oxygen, nutrients, and metabolic wastes in 2D, and the tissue‐like architecture, cell–cell, and cell–extracellular matrix interactions only achieved in 3D. The microfluidic platform is made from an organically modified ceramic material, which is inherently biocompatible and supports cell adhesion (2D culture) and metal adhesion (for integration of impedance electrodes to monitor cell proliferation). To induce 3D spheroid formation on another area, a single‐step lithography process is used to fabricate concave microwells, which are made cell‐repellant by nanofunctionalization (i.e., plasma porosification and hydrophobic coating). Thanks to the concave shape of the microwells, the spheroids produced on‐chip can also be released, with the help of microfluidic flow, for further off‐chip characterization after culturing. In this study, the methodology is evaluated for drug cytotoxicity assessment on human hepatocytes.Peer reviewe

Mechanistic study of oxygen-scavenging properties of off-stoichiometric thiol-enes

Peer reviewe

Understanding Cell Proliferation and Material induced Cell Death on Microfluidic Devices Made of Off Stoichiometric Thiol enes

Peer reviewe

Cardiac stress reactivity and recovery of novelty seekers

Peer reviewe

The characteristics and structure of extra-tropical cyclones in a warmer climate

Peer reviewe

Cell adhesion and proliferation on common 3D printing materials used in stereolithography of microfluidic devices

Three-dimensional (3D) printing has recently emerged as a cost-effective alternative for rapid prototyping of microfluidic devices. The feature resolution of stereolithography-based 3D printing is particularly well suited for manufacturing of continuous flow cell culture platforms. Poor cell adhesion or material-induced cell death may, however, limit the introduction of new materials to microfluidic cell culture. In this work, we characterized four commercially available materials commonly used in stereolithography-based 3D printing with respect to long-term (2 month) cell survival on native 3D printed surfaces. Cell proliferation rates, along with material-induced effects on apoptosis and cell survival, were examined in mouse embryonic fibroblasts. Additionally, the feasibility of Dental SG (material with the most favored properties) for culturing of human hepatocytes and human-induced pluripotent stem cells was evaluated. The strength of cell adhesion to Dental SG was further examined over a shear force gradient of 1–89 dyne per cm² by using a custom-designed microfluidic shear force assay incorporating a 3D printed, tilted and tapered microchannel sealed with a polydimethylsiloxane lid. According to our results, autoclavation of the devices prior to cell seeding played the most important role in facilitating long-term cell survival on the native 3D printed surfaces with the shear force threshold in the range of 3–8 dyne per cm².Three-dimensional (3D) printing has recently emerged as a cost-effective alternative for rapid prototyping of microfluidic devices. The feature resolution of stereolithography-based 3D printing is particularly well suited for manufacturing of continuous flow cell culture platforms. Poor cell adhesion or material-induced cell death may, however, limit the introduction of new materials to microfluidic cell culture. In this work, we characterized four commercially available materials commonly used in stereolithography-based 3D printing with respect to long-term (2 month) cell survival on native 3D printed surfaces. Cell proliferation rates, along with material-induced effects on apoptosis and cell survival, were examined in mouse embryonic fibroblasts. Additionally, the feasibility of Dental SG (material with the most favored properties) for culturing of human hepatocytes and human-induced pluripotent stem cells was evaluated. The strength of cell adhesion to Dental SG was further examined over a shear force gradient of 1-89 dyne per cm(2)by using a custom-designed microfluidic shear force assay incorporating a 3D printed, tilted and tapered microchannel sealed with a polydimethylsiloxane lid. According to our results, autoclavation of the devices prior to cell seeding played the most important role in facilitating long-term cell survival on the native 3D printed surfaces with the shear force threshold in the range of 3-8 dyne per cm(2).Peer reviewe

Fish-Liver-on-Chip: A Microfluidic Model to Assess Bioaccumulation of Environmental Drug Residues In Vitro

Peer reviewe

The material-enabled oxygen control in thiol-ene microfluidic channels and its feasibility for subcellular drug metabolism assays under hypoxia in vitro

Tissue oxygen levels are known to be critical to regulation of many cellular processes, including the hepatic metabolism of therapeutic drugs, but its impact is often ignored in in vitro assays. In this study, the material-induced oxygen scavenging property of off-stoichiometric thiol-enes (OSTE) was exploited to create physiologically relevant oxygen concentrations in microfluidic immobilized enzyme reactors (IMERs) incorporating human liver microsomes. This could facilitate rapid screening of, for instance, toxic drug metabolites possibly produced in hypoxic conditions typical for many liver injuries. The mechanism of OSTE-induced oxygen scavenging was examined in depth to enable precise adjustment of the on-chip oxygen concentration with the help of microfluidic flow. The oxygen scavenging rate of OSTE was shown to depend on the type and the amount of the thiol monomer used in the bulk composition, and the surface-to-volume ratio of the chip design, but not on the physical or mechanical properties of the bulk. Our data suggest that oxygen scavenging takes place at the polymer-liquid interface, likely via oxidative reactions of the excess thiol monomers released from the bulk with molecular oxygen. Based on the kinetic constants governing the oxygen scavenging rate in OSTE microchannels, a microfluidic device comprising monolithically integrated oxygen depletion and IMER units was designed and its performance validated with the help of oxygen-dependent metabolism of an antiretroviral drug, zidovudine, which yields a cytotoxic metabolite under hypoxic conditions.Peer reviewe