Avaliação da toxicidade das nanopartículas de dióxido de titânio(TIO2) e chumbo inorgânico pb(II) em Rhamdia quelen (Siluriformes, heptapteridae) através de ensaio agudo via injeção intraperitoneal

Orientadora : Profª Drª Marta Margarete CestariDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 23/03/2016Inclui referências : f. 88-104Área de concentração : GenéticaResumo: As Nanopartículas de dióxido de titânio (NpTiO2) fazem parte de uma inovação tecnológica que é amplamente explorada por diferentes setores industriais, entretanto, os efeitos desta nanopartícula no ambiente ainda são desconhecidos. Estresse oxidativo, citotoxicidade, neurotoxicidade e alterações na expressão de alguns genes são algumas das implicações relatadas em estudos in vivo e in vitro. O chumbo apesar de reconhecidamente tóxico, ainda é empregado na produção de acessórios para pesca, tintas, baterias, e serviços metalúrgicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade das NpTiO2 e Chumbo inorgânico (PbII), quando injetados no peixe de forma isolada ou em associação, isto devido à capacidade da nanopartícula adsorver íons e moléculas em sua superfície. Exemplares da espécie Rhamdia quelen (jundiá) foram submetidos ao ensaio agudo (96 horas), através de duas injeções intraperitoneais. Os espécimes foram divididos em 11 tratamentos: Controle negativo (CNN), Controle Negativo 1(CN1), Controle negativo 2 (CN2), 0,5ng/g NpTiO2+H2O(NP1), 5ng/g NpTiO2+H2O(NP2), 50ng/g NpTiO2+H2O(NP3), H2O+40?g/g Pb(NO3)2 (Pb), 0,5ng/g NpTiO2+40?g/g Pb(NO3)2 (NP1+Pb), 5ng/g NpTiO2+40?g/g Pb(NO3)2 (NP2+Pb), 50ng/g NpTiO2+40?g/g Pb(NO3)2 (NP3+Pb), Controle positivo (0,5?g/g MMS). Os três controles negativos foram tratados com nenhuma (CNN), uma (CN1) e duas (CN2) injeções de água destilada, com o objetivo de avaliar se a variável volumétrica administrada poderia alterar as respostas dos biomarcadores aqui utilizados. Após 96 horas, os animais foram sacrificados e os tecidos coletados. Foram realizados o teste de micronúcleo písceo com eritrócitos, o ensaio cometa com os tecidos sanguíneo, cerebral, hepático e renal. Para a análise dos biomarcadores bioquímicos foram utilizadas porções do fígado, cérebro e músculo, e para a quantificação de metal foram coletas as vísceras. O teste de micronúcleo písceo e alterações morfológicas nucleares não apresentou diferença entre os tratamentos. O ensaio cometa apresentou aumento de danos ao DNA nos tratamentos NP1 e NP2 para eritrócitos, NP1, NP3 e NP2+Pb para tecido renal, e houve uma redução de danos em NP1+Pb em tecido cerebral. Foi observado aumento da atividade da GST no grupo NP1 e NP2+Pb. A concentração de GSH aumentou em todos os tratamentos, associados e isolados. O tratamento de NP1+Pb induziu a SOD e inibiu a CAT. A enzima AChE muscular teve uma inibição em todas as doses de nanopartículas isoladas, enquanto que na AChE cerebral só houve a indução no tratamento de NP1+Pb. Foi observado um aumento da peroxidação lipídica dos tratamentos NP1, NP2 e NP1+Pb. Não foi observada nenhuma resposta padrão, dos tratamentos de associação entre as nanopartículas e o metal, que evidencie a interação entre contaminantes. Palavras chave: nanomateriais, toxicidade, ensaio cometa, peixe, biomarcadores enzimáticos.Abstract: Titanium dioxide nanoparticles (NpTiO2) are part of a technological innovation that is widely used by different industrial sectors; however, the effects causebd by them in the environment remain unknown. Oxidative stress, cytotoxicity, neurotoxicity and alteration in gene expression are some implications reported by in vivo and in vitro studies. Although recognized as toxic, lead is still used in the production of accessories for fishing, paints, batteries and metallurgical services. Thus, the aim of this work was to evaluate toxicity of NpTiO2 and inorganic lead (PbII), when they were injected into fish, alone or in association, mainly due to the ability of nanoparticles to adsorb ions and molecules on its surface. Specimens of Rhamdia quelen (common name: catfish) were submitted to acute test (96 hours), by two intraperitoneal injections (i.p.). Then, they were divided into 11 treatments: Negative Control (NC), Negative Control 1 (NC1), Negative Control 2 (NC2), 0.5 ng / g NpTiO2 + H2O (NP 1), 5 ng / g NpTiO2 + H2O (NP 2), 50ng / g NpTiO2 + H2O (NP3), H2O + 40?g / g Pb(NO3)2 (Pb), 0.5 ng / g NpTiO2 + 40?g / g Pb(NO3)2 (NP1 + Pb), 5ng / g NpTiO2 + 40?g / g Pb(NO3)2 (NP2 + Pb), 50ng / g + NpTiO2 40?g / g Pb(NO3)2 (NP3 + Pb), Positive Control (PC: 5?g / g MMS). The negative controls were treated with no (CNN), one (CN1) or two (CN2) injections of distilled water, in order to evaluate whether given variable volume could alter the biomarkers used in this study. After 96 hours, fish were sacrificed and samples collected. The piscine micronucleus test was performed as well as the comet assay with erythrocytes, brain, liver and kidney tissue. For biochemical analysis, liver parts were used, as brain and muscle tissues, to verify enzyme activity. About the lead quantification, this was performed in the fish viscera, using a pool of samples. The piscine micronucleus test and nuclear morphological alterartions did not differ between treatments. Otherwise, comet assay showed an increased in DNA damage in NP1 and NP2 treatments for erythrocytes, NP1, NP3 and NP2 + Pb for kidney tissue, and there was a reduction observed in DNA damage on group NP1 + Pb, in brain tissue. About biochemical biomarkers, there was an increase of GST activity in NP1 and NP2 + Pb group. In the same way, GSH concentration increased in all treatments in association with Pb and in isolated groups. Treatment of NP1 + Pb induced SOD and inhibited CAT activity. Muscle acetylcholinesterase inhibition was observed on groups exposed to isolated nanoparticles for all concentrations, whereas brain acetylcholinesterase activity was only induced in NP1 + Pb treatment. An increase in lipid peroxidation of treatments NP1, NP2 and NP1 + Pb was observed. In conclusion, there has been no standard response in association treatments between nanoparticles and the metal (Pb) that reveals the interaction between contaminants. Keywords: nanomaterials, toxicity, comet assay, fish, enzymatic biomarkers

Avaliação genotóxica em eritrócitos e tecido cerebral de Rhamdia quelen (Siluriformes, Heptapteridae) após exposição aguda à nanopartícula de dióxido de titãnio (TiO2) e chumbo inorgãnico Pb(II)

Orientadora: Marta Margarete CestariCoorientadora: Tatiane KlingelfusMonografia (Bacharelado) - Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Curso de Graduação em Ciências BiológicasResumo : Nanopartículas são potencialmente atrativas às indústrias devido as suas propriedades físico-químicas, porém as consequências da sua presença no ambiente aquático ainda são desconhecidas. O chumbo, outro elemento muito utilizado por indústrias, é tóxico e pode causar danos aos organismos em níveis histológicos, genéticos e bioquímicos. O trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos genotóxicos da Nanopartícula de Dióxido de Titânio (NPTiO2) do Chumbo Inorgânico (PbII) e da associação destes xenobióticos, em sangue e tecido cerebral na espécie Rhamdia quelen. Esta espécie é nativa, onívora, reproduzida em pisciculturas e de fácil manutenção em laboratório. Foram realizados bioensaios agudos (96 horas) via injeção intraperitoneal, no qual os espécimes foram divididos em 10 grupos: 2 controles negativos, 5ng/g NPTiO2, 50ng/g NPTiO2, 500ng/g NPTiO2, 21?g/g PbII, 5ng/g NPTiO2 + 21?g/g PbII, 50ng/g NPTiO2 +21?g/g PbII, 500ng/g NPTiO2 +21?g/g PbII, Controle Positivo (Metil Metano Sulfonato na dose 0,5?g/g). Sangue e cérebro foram coletados para a realização do teste do micronúcleo písceo e alterações morfológicas nucleares e do ensaio cometa, respectivamente. Foi observado que grupo exposto ao PbII não apresentou toxicidade em tecido cerebral ou em eritrócitos quando comparado ao grupo controle negativo. Sabe-se que o chumbo é neurotóxico, e provavelmente não foi observada genotoxicidade em tecido cerebral devido ao curto tempo de exposição. O grupo contaminado com 5ng/g NPTiO2 apresentou maiores danos tanto em cérebro quanto em eritrócito. Entre as alterações morfológicas nucleares mais observadas no grupo de 5ng/g NPTiO2 destacou-se o tipo vacuolated. Todos os grupos de associação entre NPTiO2 e PbII não apresentaram diferenças significativas quando comparados entre si, tanto no ensaio cometa em tecido cerebral, quanto na análise de alterações morfológicas totais em eritrócitos. A utilização de doses baixas de nanopartículas demonstrou que, provavelmente, sua capacidade de agregação pode ter sido reduzida, facilitando a distribuição no organismo e a entrada nas células, proporcionando assim a observação da genotoxicidade de NPTiO2 em tecido cerebral e eritrócitos de Rhamdia quelen

Co-exposure effects of Titanium Dioxide Nanoparticles and Metals on antioxidant systems and DNA in the fish Hoplias intermedius

Metallic nanoparticles are one of the most produced and used engineered nanomaterial and their wide applications lead to environmental contamination. The aquatic environment is the major recipient of wastes containing nanoparticles and other co-occuring contaminants. We aimed to evaluate genotoxic and biochemical effects of acute exposure to nano-TiO2 in the fish Hoplias intermedius and the interaction to metals. Besides assessing the nanoparticles’ physical-chemical properties we performed an acute exposure with 0.1; 1; 10 μg g-1 nano-TiO2, alone and with lead (21 μgg-1) and aluminium (50 μgg-1). A set of biomarkers were evaluated in the liver such as genotoxicity by comet assay and biochemical biomarkers (SOD, CAT, GPx, GSH, EROD, GST). Most of the biomarkers were altered by the metals, and the nanoparticles caused decrease in SOD (0.1 and 1μg g-1), GSH (1μg g-1), and GST (0.1 μg g-1). In co-exposure, some metal effects were attenuated. There was an increase in EROD activity for most co-exposure groups. Nano-TiO2 was not genotoxic in the experimental conditions. We did not observe any increase in DNA breaks in co-exposure, although, nanoparticles changed the response of some biochemical biomarkers

Avaliação da toxicidade de Di-N-Butil Ftalato (DBP) e Diisopentil Ftalato em Rhamdia quelen (Siluriformes, Heptapteridae) após exposições via trófica subcrônica à baixas doses

Orientadora: Prof.a Dr.a Marta Margarete CestariCoorientadoras: Profa. Dra. Daniela Morais Leme e Dra. Taynah VicariTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 30/09/2020Inclui referências: p. 82-111Área de concentração: GenéticaResumo: Ftalatos, ou ésteres de ácido ftálico, são moléculas orgânicas produzidas sinteticamente para uso industrial como plastificantes, umectante, fixadores, solventes em diversos ramos industriais. O di-n-butil ftalato (DBP) é um dos ftalatos mais produzidos e utilizados no mundo, apesar de sua proibição em cosméticos e produtos de cuidado pessoal, ainda é amplamente utilizado em adesivos, tintas e vernizes, e principalmente na produção de policloreto de vinila (PVC). Assim como outros ftalatos, o DBP também é conhecido por ser desregulador endócrino e promover efeitos reprodutivos em animais. No Brasil, recentemente foi descoberta a exposição de humanos ao diisopentil ftalato (DiPeP) por meio da detecção de metabólitos na urina de gestantes e crianças. A produção do DiPeP no Brasil é alta devido à disponibilidade de álcool isoamílico advindo do processo de refino da cana de açúcar para a produção de etanol. Assim como o DBP, o DiPeP também é proibido em itens de cuidado pessoal, mas é utilizado pela indústria de maneiras semelhantes. Entretanto, pouco se sabe a respeito da toxicidade do DiPeP. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar a potencial toxicidade dos ftalatos DBP e DiPeP em exposições subcrônicas em uma espécie nativa (Rhamdia quelen). Foi desenvolvido um desenho experimental em condições ambientalmente relevantes com exposição trófica e baixas doses (5 ng/g, 25 ng/g, 125 ng/g) administradas a cada 48 horas por 30 dias. Foram avaliados parâmetros hematológicos, formação de micronúcleos e alterações eritrocitárias nucleares, danos ao DNA de células sanguíneas, hepáticas, renais e cerebrais, atividade das enzimas glutationa S-transferase (GST), superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), concentração GSH e peroxidação lipídica (LPO) nos tecidos hepático e renal, além da atividade da acetilcolinesterase (AChE) muscular e cerebral. Os resultados mostraram que não houve efeito no tecido sanguíneo que pudesse ser identificado pelos biomarcadores hematológicos e genéticos. Também não observamos genotoxicidade nos tecidos cerebral e hepático. Entretanto, por meio dos biomaradores bioquímicos, observamos um desequilíbrio no sistema antioxidante de rim e fígado. No rim, ambos os ftalatos reduziram a concentração de GSH e a atividade da SOD e promoveram o aumento de danos ao DNA renal, porém, o DiPeP, para esses três biomarcadores, mostrou o efeito em todas as doses de forma semelhante, enquanto o DBP em apenas uma das doses administradas. Além disso, o DiPeP reduziu a atividade da GPx e a LPO, que não foi observada nos grupos tratados com DBP. No tecido hepático, apesar de não terem sido genotóxicos, ambos os ftalatos causaram aumento da atividade da GST. O tecido cerebral mostrou-se um potencial alvo ao aumentar a atividade da AChE tanto na presença de DBP quanto DiPeP, entretanto, o último promoveu a redução da atividade no músculo em todos os tratamentos. Assim, o presente estudo reforça a preocupação com a presença de ftalatos no ambiente, uma vez que esses mostraram-se potenciais agentes nefrotóxicos e neurotóxicos. O DiPeP mostrou-se tão tóxico quanto o DBP, evidenciando a importância de estudos de toxicidade e biomonitoramento do ecossistema aquático.Abstract: Phthalates, or phthalic acid esters, are organic molecules produced synthetically for industrial use as plasticizers, humectants, fixatives, solvents in various industrial sectors. Di-n-butyl phthalate (DBP) is one of the most produced and used phthalates globally, despite its prohibition in cosmetics and personal care products, it is still widely used in adhesives, paints and varnishes, and mainly in the production of polychloride vinyl (PVC). Like other phthalates, DBP is also known to be an endocrine disruptor and promote reproductive effects in animals. In Brazil, human exposure to diisopentyl phthalate (DiPeP) was recently discovered by detecting metabolites in the urine of pregnant women and children. The production of DiPeP in Brazil is high due to the availability of isoamyl alcohol resulting from the sugar cane refining process for the production of ethanol. Like DBP, DiPeP is also prohibited in personal care items, but it is used by the industry in similar ways. However, little is known about the toxicity of DiPeP. Thus, the objective of the present study was to evaluate the potential toxicity of phthalates DBP and DiPeP in subchronic exposures in a native species (Rhamdia quelen). An experimental design was developed under environmentally relevant conditions with trophic exposure and low doses (5 ng / g, 25 ng / g, 125 ng / g) administered every 48 hours for 30 days. Hematological parameters, micronucleus formation and nuclear erythrocyte alterations, damage to the DNA of blood, liver, kidney and brain cells, activity of the enzymes glutathione S-transferase (GST), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), GSH concentration and lipid peroxidation (OLP) in the hepatic and renal tissues, in addition to the muscle and brain acetylcholinesterase (AChE) activity were evaluated. The results showed no effect on blood tissue that could be identified by hematological and genetic biomarkers. We also did not observe genotoxicity in the brain and liver tissues. However, through biochemical biomarkers, we observed an imbalance in the kidney and liver antioxidant system. Both phthalates reduced the GSH concentration and SOD activity in the kidney and promoted increased damage to renal DNA. However, DiPeP, for these three biomarkers, showed the effect in all doses similarly, while DBP in only one of the doses administered. Besides that, DiPeP reduced the GPx activity and LPO, which was not seen in the groups treated with DBP. Although they were not genotoxic in the liver tissue, both phthalates caused an increase in GST activity. Brain tissue proved to be a potential target by increasing AChE activity both in the presence of DBP and DiPeP, however, the latter promoted a reduction in muscle activity in all treatments. Thus, the present study reinforces the concern with the presence of phthalates in the environment, since these have shown to be potential nephrotoxic and neurotoxic agents. DiPeP proved to be as toxic as DBP, showing the importance of studies on toxicity and biomonitoring of the aquatic ecosystem