Comparison of three hyposmotic solutions to evaluate the integrity of plasmatic sperm membrane in cryopreserved and thawed bull semen

El objetivo de este trabajo fue comparar la sensibilidad de tres medios hiposmóticos (HOST) para valorar la integridad funcional de la membrana plasmática (IFMP) de espermatozoides obtenidos de semen criopreservado de 12 toros. Se compararon tres soluciones con diferentes osmolaridades (0; 102 y 154 mOsm/Kg) que se incubaron a 37°C en baño María. La solución con 0 mOsm/kg (A: agua ultra pura) fue incubada durante cinco minutos (min), mientras que las dos restantes con diferentes concentraciones de cloruro de sodio se incubaron durante 30 min. La solución B y C constan de medios hiposmóticos a 102 y 154 mOsm/kg, respectivamente. Se tomaron tres muestras (100 µL) de semen descongelado por toro que se introdujeron en viales que contenían 1000 µL de cada solución hiposmótica. Sobre frotis realizados con cada medio y teñidos con Eosina-nigrosina (EN) se evaluaron 100 espermatozoides para determinar (en conjunto) el porcentaje de viabilidad y de flagelos reaccionados (FR). La asociación del HOST con la EN fue realizada para identificar los espermatozoides vivos o muertos con FR o intactos. Los resultados demuestran mejores porcentajes de espermatozoides con FR para las soluciones B (49,75 ± 4,17) y C (56,33 ± 4,17) versus la solución A (32,16 ± 4,17) (P<0,05). Cuando se asociaron los FR con el porcentaje de supervivencia se observó la misma tendencia (A= 8,75 ± 1,56 versus B: 26,33 ± 3,46 y C: 29,41 ± 2,67). Estos valores indican que las condiciones B y C son medios hiposmóticos apropiados para la valoración de los espermios, ya que propician la torsión helicoidal del flagelo manteniendo la IFMP del espermatozoide en el 52% de los casos. Se concluye que la condición osmolar A no se recomienda debido a que causa pérdida de la IFMP y muerte celular, lo cual quedó en evidencia al apreciar que solo un 8% de espermatozoides con flagelos reaccionados sobreviven luego del un estrés osmótico tan [email protected] objective of this study was to compare the sensitivity of three hyposmotic test (HOST) to evaluate the functional integrity of the plasmatic sperm membrane (IFMP) obtained from cryopreserved semen of 12 bulls. Were compared three solutions with different osmolarities (0,102 and 154 mOsm/kg) which were incubated at 37°C in a water bath. The solution with 0 mOsm/kg (A: ultra pure water) was incubated for five minutes (min), while of two remaining with different concentrations of sodium chloride were incubated for 30 min. Solution B and C comprise a hyposmotic media at 102 mOsm/kg and 154 mOsm/kg, respectively. Three samples were taken (100 µL) of thawed semen per bull, that were Introduced in vials containing 1000 µL of each hyposmotic solution. About smears performed with each medium hyposmotic and stained with eosin and nigrosin (EN), 100 spermatozoa were evaluated to determine (together) the percentages of viability and swelling flagellas (FR). The association of the HOST with EN was performed to identify the percentage of spermatozoas live or dead with FR or intacts. The results of the HOST demonstrated higher percentages of spermatozoes with FR for treatments B (49.75 ± 4.17) and C (56.33 ± 4.17) versus treatment A (32.16 ± 4.17) (P<0.05). These values indicate that the conditions B and C are optimal solutions, propitiating the helical twist of the flagellum, maintaining the IFMP of the sperm in 52% of cases. The osmolar condition A is not recommended because it causes loss of IFMP and cell death, thus was in evidence to appreciate that only 8% of sperm with flagella reacted survive after osmotic stress as low

Sperm with damaged and immature chromatin in cryopreserved semen from brahman bulls.

El propósito de este estudio fue cuantificar la presencia de espermatozoides con cromatina dañada e inmadura en el semen criopreservado de toros Brahman. Para ello, frotis de tres eyaculados de cinco toros fueron teñidos con azul de toluidina (AT) y azul de anilina (AN) para evaluar integridad y la inmadurez de la cromatina, respectivamente. Los espermatozoides teñidos con AT fueron considerados espermatozoides con cromatina normal (teñidos de azul claro) o con cromatina dañada (teñidos de azul oscuro o violeta), mientras que los teñidos con AN fueron clasificados como maduros (no teñidos) o inmaduros (teñidos de azul). El porcentaje de espermatozoides con cromatina dañada fue de 7,0 ± 3,71; rango entre 3 y 17,5%. Se observaron efectos del toro y el eyaculado sobre el porcentaje de espermatozoides con cromatina dañada (P<0,05). El porcentaje de espermatozoides con cromatina inmadura fue de 0,9 ± 1,29% (rango de 0 a 2,5%). No se observaron efectos del toro o el eyaculado; no obstante, solo siete de los eyaculados presentaron espermatozoides con cromatina inmadura. No se observó una correlación entre el porcentaje de espermatozoides con cromatina dañada y el de espermatozoides con cromatina inmadura (r = -0,05; P= 0,77). En conclusión, el semen criopreservado de toros Brahman contiene bajos porcentajes de espermatozoides con cromatina dañada y de espermatozoides con cromatina inmadura. Adicionalmente, este estudio demuestra que las tinciones de azul de toluidina y azul de anilina evalúan diferentes características de la cromatina.20 - [email protected] purpose of this study was to quantify the presence of sperm with damaged and immature chromatin in cryopreserved semen from Brahman bulls. In order the achieve that goal, smears of three ejaculates from five Brahman bulls were stained with toluidine blue (AT) and aniline blue (AN) to evaluate integrity and immaturity of chromatin, respectively. Sperm stained with AT were classified as having normal chromatin (stained light blue) or damaged chromatin (stained dark blue or violet); while sperm stained with AN were classified as mature sperm (unstained) or immature sperms (stained blue). Percentage of sperm with damaged chromatin was 7.0 ± 3.71%, with a range from 3 to 17.5%. Bull and ejaculate effects were observed on the percentage of sperm with damaged chromatin (P<0.05). Percentage of immature chromatin was 0.9 ± 1.29% (from 0 to 2.5%). No effects of bull or ejaculate were observed, and only seven ejaculates presented sperm with immature chromatin. No correlation was observed between damaged and immature chromatin (r = -0.05, P=0.77). In conclusion, Brahman bull semen contains low percentages of sperm with damaged and immature chromatin. Additionally, this study demonstrates that toluidine blue and aniline blue stains evaluate different chromatin characteristics

CRIOPROCESADO DE SEMEN OVINO: EFECTO SOBRE EL PATRÓN DE MOTILIDAD Y LA DISTRIBUCIÓN DE SUBPOBLACIONES ESPERMÁTICAS.

La incorporación de computadoras (CASA) a la evaluación de la calidad seminal ha hecho posible el establecimiento de métodos de valoración de la motilidad espermática en forma objetiva, sin el juicio discrecional de un operador. Con el fin de determinar el efecto del proceso de criopreservación sobre el patrón de motilidad espermática, se evaluaron 5 eyaculados por morueco, en tres momentos: a la colecta, luego de la refrigeración a 5°C y luego del descongelado, pertenecientes al Centro Experimental de Producción Animal (CEPA) en Zulia, Venezuela. El análisis computarizado de la motilidad espermática (CASA) fue realizado para cuantificar la progresividad de movimiento de los espermatozoides. El procedimiento FASTCLUS se utilizó para identificar las subpoblaciones y su distribución porcentual en semen recién colectado, refrigerado y descongelado (Chi cuadrado). El efecto directo de la criopreservación sobre las variables dependientes fue analizado con el procedimiento GLM (SAS®) y cuando se observaron diferencias se cuantificaron los efectos mediante el LSMEANS. Todos los valores de calidad espermática estudiados fueron afectados significativamente (P<0,001) por la criopreservación (progresividad y subpoblaciones). Los espermatozoides tuvieron significativamente (P<0,001) menor motilidad en semen refrigerado/criopreservado que en fresco para todos los ovinos. Fue posible identificar 4 grupos (o subpoblaciones) de motilidad diferentes (P<0,001) que coexisten (o coexistiendo) en el eyaculado. En conclusión, el presente estudio confirma que la criopreservación afecta la célula espermática de manera importante, comprometiendo los valores referenciales que cuantifican la calidad seminal, sobretodo el movimiento espermático.ABSTRACTComputerized evaluation of seminal quality parameters (CASA) has made it possible to establish objective methods for assessing sperm motility without the subjective judgment of the operator. With the aim of evaluating objectively the effects of sperm cryopreservation process on spermatic motility y sperm distribution into subpopulations according to motility, as well as on the changes in sperm during cryoprocessing, 5 ejaculates, 5 refrigerated samples (5ºC) and 5 frozen straws (-196ºC) per ram/session were evaluated. Rams belonged to the Experimental Center for Animal Production (CEPA) in Zulia, Venezuela. Computerized analyses of sperm motility (CASA) were performed to quantify sperm progressive movement. FASTCLUS procedure was used to identify subpopulations. These data were analyzed using the GLM procedure (SAS®) and when significant differences were observed, effects were quantified using the LSMEANS statement. All values of sperm quality were significantly affected (P <0.001) by cryopreservation (progressivity and subpopulations). Spermatozoa were significantly (P <0.001) with less motility in cooled/cryopreserved semen than those in fresh semen for all rams. It was possible to identify four sperm subpopulations with different motility characteristics (P <0.001) that coexist in the ejaculate. In conclusion, the present study confirms that cryopreservation affects the sperm cell significantly, compromising semen quality, especially sperm movement

Use of water test to assess the sperm membrane functional integrity in cryopreserved bull semen

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Summary The aim of this study was to determine the percentage of sperm with damaged chromatic measure with toluidine blue stain and it´s relationship with motility and viability in criopreserverd semen from Brahman bulls. Three ejaculates from six Brahman bulls were used. Immediately after thawing, sperms were stained with toluidine blue to establish chromatin integrity (sperms with normal chromatin were light blue or green while sperms with damaged chromatin were dark blue or violet). Sperms were also stained with eosin-nigrosin to determine viability (live sperms were unstained while dead sperms were pink). Motility was measured under light microscope. Effects of bull, ejaculate, and the interaction between variables were assessed. The percentage of live sperms was 50.02 ( ± 14.13%). The mean motility was 33.88 (± 12.43%), while the percentage of sperms with damaged chromatin was 4.17 ( ± 2.96%). Viability was positively correlated with motility (r=0.77217, p=0.0002), and negatively correlated with damaged chromatin sperms (r= -0.43104, p=0.0087). Motility percentage was negatively correlated with the percentage of sperms with damaged chromatin (r=-0.48337, p=0.0421). In conclusion, cryopreserved semen of Brahman bulls presented a low level of chromatin damage, and this trait was negatively correlated with sperm motility and viability

Relationship among damaged chromatin, motility and viability in cryopreserved spermatozoa from Brahman bulls

The aim of this study was to determine the percentage of sperm with damaged chromatic measure with toluidine blue stain and it´s relationship with motility and viability in criopreserverd semen from Brahman bulls. Three ejaculates from six Brahman bulls were used. Immediately after thawing, sperms were stained with toluidine blue to establish chromatin integrity (sperms with normal chromatin were light blue or green while sperms with damaged chromatin were dark blue or violet). Sperms were also stained with eosin-nigrosin to determine viability (live sperms were unstained while dead sperms were pink). Motility was measured under light microscope. Effects of bull, ejaculate, and the interaction between variables were assessed. The percentage of live sperms was 50.02 ( ± 14.13%). The mean motility was 33.88 (± 12.43%), while the percentage of sperms with damaged chromatin was 4.17 ( ± 2.96%). Viability was positively correlated with motility (r=0.77217, p=0.0002), and negatively correlated with damaged chromatin sperms (r= -0.43104, p=0.0087). Motility percentage was negatively correlated with the percentage of sperms with damaged chromatin (r=-0.48337, p=0.0421). In conclusion, cryopreserved semen of Brahman bulls presented a low level of chromatin damage, and this trait was negatively correlated with sperm motility and viability.O objectivo deste estudo foi determinar a percentagem de espermatozóides com cromatina danificada, determinada pela coloração com azul de toluidina e sua relação com a viabilidade e a mobilidade do esperma cripreservado de touros Brahman. Para isso, foram utilizados três ejaculados de sêmen de seis touros Brahman, que uma vez descongelado foram coradas com azul de toluidina para determinar a integridade da cromatina (espermatozóides com cromatina normal coloream de azul ou verde; cromatina de espermatozóides con cromatina danificada, coloream de azul escuro ou violeta). Também foram corados com eosina nigrosina para determinar a viabilidade (espermatozóides vivos permanecem brancos e os mortos de cor rosa) e a motilidade espermática foi estimada por microscopia de luz. Foram encontradas diferenças significativas em todos os parâmetros, devido ao efeito de touro e o ejaculado, bem como a interacção entre essas duas variáveis. A percentagem de espermatozóides vivos foi de 50.02 ± 14.13% e motilidade espermática média de 33.88 ± 12.43%, enquanto a percentagem de espermatozóides com cromatina danificada foi de 4.17 ± 2.96%. A percentagem de espermatozóides vivos foi positivamente correlacionada com a motilidade (r=0.77217, p=0.0002) e negativamente com a porcentagem de espermatozóides com cromatina danificada (r = -0.43104, p= 0.0087), enquanto que a percentagem de motilidade correlacionou negativamente com a percentagem de espermatozóides com cromatina danificada (r = -0.48337, p=0.0421). Em conclusão, o sêmen de touros Brahman criopreservados tem um baixo nível de dano da cromatina, que está correlacionada negativamente com a motilidade e a vitalidade do esperma.El objetivo del presente trabajo fue determinar el porcentaje de espermatozoides con cromatina dañada medida con la tinción de azul de toluidina, y su relación con la motilidad y la vitalidad del semen criopreservado de toros Brahma. Para ello, se utilizó semen de tres eyaculados de seis toros Brahman, el cual una vez descongelado se procedió a teñir con azul de toluidina para determinar la integridad de la cromatina (espermatozoides con cromatina normal teñidos de azul o verde claro; espermatozoides con cromatina anormal teñidos de azul oscuro o violeta), también se tiñeron con eosinanigrosina para determinar la viabilidad (espermatozoides vivos permanecen blancos; espermatozoides muertos se tiñen de rosado) y se estimó la motilidad espermática mediante microscopía óptica. Se evidenciaron las diferencias en todos los parámetros evaluados debidas al efecto toro y al eyaculado, así como a la interacción entre estas dos variables. El porcentaje de espermatozoides vivos fue de 50.02 ± 14.13% y la motilidad espermática promedió un 33.88 ± 12.43%, mientras que el porcentaje de espermatozoides con cromatina dañada fue de 4.17 ± 2.96%. El porcentaje de espermatozoides vivos se correlacionó positivamente con la motilidad (r=0.77217, p=0.0002), y negativamente con el porcentaje de espermatozoides con cromatina dañada (r= -0.43104, p=0.0087), mientras que el porcentaje de motilidad se correlacionó negativamente con el porcentaje de espermatozoides con cromatina anormal (r= -0.48337, p=0.0421). En conclusión, el semen criopreservado de toros Brahman presenta un bajo nivel de espermatozoides con daño en la cromatina, lo cual se correlaciona negativamente con la motilidad y la vitalidad espermática

Relationship among damaged chromatin, motility and viability in cryopreserved spermatozoa from Brahman bulls Relación entre la alteración de la cromatina, movilidad y viabilidad en espermatozoides criopreservados de toros Brahman Relação entre a alteração da cromatina, motilidade e viabilidade dos espermaotozoides criopreservados de touros Brahman

The aim of this study was to determine the percentage of sperm with damaged chromatic measure with toluidine blue stain and it´s relationship with motility and viability in criopreserverd semen from Brahman bulls. Three ejaculates from six Brahman bulls were used. Immediately after thawing, sperms were stained with toluidine blue to establish chromatin integrity (sperms with normal chromatin were light blue or green while sperms with damaged chromatin were dark blue or violet). Sperms were also stained with eosin-nigrosin to determine viability (live sperms were unstained while dead sperms were pink). Motility was measured under light microscope. Effects of bull, ejaculate, and the interaction between variables were assessed. The percentage of live sperms was 50.02 ( ± 14.13%). The mean motility was 33.88 (± 12.43%), while the percentage of sperms with damaged chromatin was 4.17 ( ± 2.96%). Viability was positively correlated with motility (r=0.77217, p=0.0002), and negatively correlated with damaged chromatin sperms (r= -0.43104, p=0.0087). Motility percentage was negatively correlated with the percentage of sperms with damaged chromatin (r=-0.48337, p=0.0421). In conclusion, cryopreserved semen of Brahman bulls presented a low level of chromatin damage, and this trait was negatively correlated with sperm motility and viability.El objetivo del presente trabajo fue determinar el porcentaje de espermatozoides con cromatina dañada medida con la tinción de azul de toluidina, y su relación con la motilidad y la vitalidad del semen criopreservado de toros Brahma. Para ello, se utilizó semen de tres eyaculados de seis toros Brahman, el cual una vez descongelado se procedió a teñir con azul de toluidina para determinar la integridad de la cromatina (espermatozoides con cromatina normal teñidos de azul o verde claro; espermatozoides con cromatina anormal teñidos de azul oscuro o violeta), también se tiñeron con eosinanigrosina para determinar la viabilidad (espermatozoides vivos permanecen blancos; espermatozoides muertos se tiñen de rosado) y se estimó la motilidad espermática mediante microscopía óptica. Se evidenciaron las diferencias en todos los parámetros evaluados debidas al efecto toro y al eyaculado, así como a la interacción entre estas dos variables. El porcentaje de espermatozoides vivos fue de 50.02 ± 14.13% y la motilidad espermática promedió un 33.88 ± 12.43%, mientras que el porcentaje de espermatozoides con cromatina dañada fue de 4.17 ± 2.96%. El porcentaje de espermatozoides vivos se correlacionó positivamente con la motilidad (r=0.77217, p=0.0002), y negativamente con el porcentaje de espermatozoides con cromatina dañada (r= -0.43104, p=0.0087), mientras que el porcentaje de motilidad se correlacionó negativamente con el porcentaje de espermatozoides con cromatina anormal (r= -0.48337, p=0.0421). En conclusión, el semen criopreservado de toros Brahman presenta un bajo nivel de espermatozoides con daño en la cromatina, lo cual se correlaciona negativamente con la motilidad y la vitalidad espermática.O objectivo deste estudo foi determinar a percentagem de espermatozóides com cromatina danificada, determinada pela coloração com azul de toluidina e sua relação com a viabilidade e a mobilidade do esperma cripreservado de touros Brahman. Para isso, foram utilizados três ejaculados de sêmen de seis touros Brahman, que uma vez descongelado foram coradas com azul de toluidina para determinar a integridade da cromatina (espermatozóides com cromatina normal coloream de azul ou verde; cromatina de espermatozóides con cromatina danificada, coloream de azul escuro ou violeta). Também foram corados com eosina nigrosina para determinar a viabilidade (espermatozóides vivos permanecem brancos e os mortos de cor rosa) e a motilidade espermática foi estimada por microscopia de luz. Foram encontradas diferenças significativas em todos os parâmetros, devido ao efeito de touro e o ejaculado, bem como a interacção entre essas duas variáveis. A percentagem de espermatozóides vivos foi de 50.02 ± 14.13% e motilidade espermática média de 33.88 ± 12.43%, enquanto a percentagem de espermatozóides com cromatina danificada foi de 4.17 ± 2.96%. A percentagem de espermatozóides vivos foi positivamente correlacionada com a motilidade (r=0.77217, p=0.0002) e negativamente com a porcentagem de espermatozóides com cromatina danificada (r = -0.43104, p= 0.0087), enquanto que a percentagem de motilidade correlacionou negativamente com a percentagem de espermatozóides com cromatina danificada (r = -0.48337, p=0.0421). Em conclusão, o sêmen de touros Brahman criopreservados tem um baixo nível de dano da cromatina, que está correlacionada negativamente com a motilidade e a vitalidade do esperma

Effect of chromatin integrity on bull sperm head morphometry

Con el propósito de determinar el efecto de la integridad de la cromatina sobre las dimensiones morfométricas (largo, ancho, área, perímetro, elipticidad) de la cabeza espermática, se evaluaron mediante un sistema computarizado de análisis de morfometría espermática, 2273 cabezas de espermatozoides de toros Brahman, las cuales fueron teñidas con azul de toluidina para determinar el estatus de la cromatina, resultando 1599 con cromatina normal y 674 con cromatina dañada. La integridad de la cromatina afectó significativamente tres de los parámetros evaluados. Los espermatozoides con cromatina dañada presentaron mayor ancho (4,32 ± 0,009µm, P<0,05) y área (29,91 ± 0,009 µm2, P<0,05) que los espermatozoides con cromatina normal (ancho: 4,22 ± 0,006 µm; área: 29,23 ± 0,06 µm2). No se observaron diferencias significativas en la longitud y el perímetro, sin embargo, la elipticidad fue menor en los espermatozoides con cromatina dañada (1,83 ± 0,004, P<0,05) que en los espermatozoides con cromatina normal (1,87 ± 0,003). Los resultados del presente estudio sugieren que la cromatina dañada genera un pequeño incremento en el tamaño de la cabeza espermática haciéndola más redondeada. Mayores investigaciones son necesarias a fin de determinar la implicación de estos hallazgos sobre el potencial reproductivo de toros.67 - [email protected] order to evaluate the effect of chromatin integrity on the morphometric dimensions (length, width, area, perimeter, ellipticity) of the bull sperm head, 2273 sperm heads from Brahman bulls were evaluated by using a computerized system to sperm morphometry analysis. Sperms were stained with toluidine blue to determine the chromatin status, resulting in 1599 heads with normal chromatin and 674 heads with damaged chromatin. Chromatin integrity affected significantly three of five parameters evaluated. Sperm with damaged chromatin had more width (4.32 ± 0.009µm, P<0.05) and area (29.91 ± 0.09µm2, P<0.05) than sperm with normal chromatin (width: 4.22 ± 0.006µm; area: 29.23 ± 0.06µm2). No significant differences in the length and perimeter were observed, while ellipticity were decreased in sperm with damaged chromatin (1.83 ± 0.004, P<0.05) in comparison with sperm with normal chromatin (1.87 ± 0.003). Results of this study demonstrate that damaged chromatin results in a subtle increase of sperm head size making this more rounded and that simultaneous evaluation of chromatin integrity and sperm head morphometry is possible. Further research is needed to determine the implications of these findings on the reproductive potential of bulls

Carotenoides en agroalimentación y salud

Los carotenoides son compuestos especiales; si bien es común referirse a ellos como pigmentos, lo cierto es que son compuestos de gran versatilidad e importancia en la naturaleza. Más específicamente, son de gran interés en agroalimentación y salud. Así, por ejemplo, son pigmentos naturales y por lo tanto tienen un importante papel en la elección de alimentos por parte de los consumidores. Asimismo, algunos de ellos son precursores de la vitamina A. Sin embargo, que cada vez exista más interés en los carotenoides en este contexto se debe en gran parte a muchos estudios de distinta naturaleza que indican que pueden proporcionar beneficios para la salud. Su interés en alimentación funcional es por lo tanto indudable. En este libro se refleja la experiencia en carotenoides de un gran número de profesionales de la región iberoamericana. En conjunto, se ofrece una visión general de la investigación sobre estos compuestos en agroalimentación y salud. Los autores son miembros de la red ibercarot (http://carotenoides.us.es), que tiene entre sus objetivos conformar una red estable y funcional de profesionales que aúnen esfuerzos en pos de identificar nuevas fuentes de carotenoides de interés nutricional, mejorar su producción y aumentar el valor de los productos que los contengan. Me gustaría agradecer a todas y cada una de las personas que han contribuido de una u otra forma a que este libro sea una realidad. Todos esperamos que sea de ayuda para personas interesadas en los temas desarrollados. Gracias especialmente al Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (Cyted, http:// www.cyted.org/) que, con su apoyo económico a la red ibercarot, ha hecho posible que varias decenas de equipos interaccionen en torno a temas de interés común para contribuir al desarrollo a distintos niveles de la región iberoamericana.RED TEMÁTICA IBERCAROT (referencia 112RT445) http://carotenoides.us.es PROGRAMA IBEROAMERICANO DE CIENCIA Y TECNOLOGIA PARA EL DESARROLLO – CYTEDPeer reviewe