Association with an ammonium-excreting bacterium allows diazotrophic culture of oil-rich eukaryotic microalgae

Concerns regarding the depletion of the world's reserves of oil and global climate change have promoted an intensification of research and development toward the production of biofuels and other alternative sources of energy during the last years. There is currently much interest in developing the technology for third-generation biofuels from microalgal biomass mainly because of its potential for high yields and reduced land use changes in comparison with biofuels derived from plant feedstocks. Regardless of the nature of the feedstock, the use of fertilizers, especially nitrogen, entails a potential economic and environmental drawback for the sustainability of biofuel production. In this work, we have studied the possibility of nitrogen biofertilization by diazotrophic bacteria applied to cultured microalgae as a promising feedstock for next-generation biofuels. We have obtained an Azotobacter vinelandii mutant strain that accumulates several times more ammonium in culture medium than wild-type cells. The ammonium excreted by the mutant cells is bioavailable to promote the growth of nondiazotrophic microalgae. Moreover, this synthetic symbiosis was able to produce an oil-rich microalgal biomass using both carbon and nitrogen from the air. This work provides a proof of concept that artificial symbiosis may be considered an alternative strategy for the low-N-intensive cultivation of microalgae for the sustainable production of next-generation biofuels and other bioproducts.Fil: Ortiz Marquez, Juan César Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Do Nascimento, Mauro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Dublan, María de Los Ángeles. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Curatti, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentin

Plant-adapted Escherichia coli show increased lettuce colonizing ability, resistance to oxidative stress and chemotactic response

Background: Escherichia coli is a widespread gut commensal and often a versatile pathogen of public health concern. E. coli are also frequently found in different environments and/or alternative secondary hosts, such as plant tissues. The lifestyle of E. coli in plants is poorly understood and has potential implications for food safety. Methods/Principal Findings: This work shows that a human commensal strain of E. coli K12 readily colonizes lettuce seedlings and produces large microcolony-like cell aggregates in leaves, especially in young leaves, in proximity to the vascular tissue. Our observations strongly suggest that those cell aggregates arise from multiplication of single bacterial cells that reach those spots. We showed that E. coli isolated from colonized leaves progressively colonize lettuce seedlings to higher titers, suggesting a fast adaptation process. E. coli cells isolated from leaves presented a dramatic rise in tolerance to oxidative stress and became more chemotactic responsive towards lettuce leaf extracts. Mutant strains impaired in their chemotactic response were less efficient lettuce colonizers than the chemotactic isogenic strain. However, acclimation to oxidative stress and/or minimal medium alone failed to prime E. coli cells for enhanced lettuce colonization efficiency. Conclusion/Significance: These findings help to understand the physiological adaptation during the alternative lifestyle of E. coli in/on plant tissues.Fil: Dublan, María de Los Ángeles. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones En Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Ortiz Marquez, Juan César Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones En Biodiversidad y Biotecnología; Argentina. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; ArgentinaFil: Lett, Lina Analía Carola. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires; ArgentinaFil: Curatti, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones En Biodiversidad y Biotecnología; Argentina. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; Argentin

Bioprospecting for fast growing and biomass characterization of oleaginous microalgae from South-Eastern Buenos Aires, Argentina

As part of pioneering efforts to assess the potential of native microalgae as biofuel feedstock in South–Eastern Buenos Aires, 34 monoalgal cultures (corresponding to the Phylum Chlorophyta) were established and 21 were selected for further growth and biomass composition characterization. Novel RNA sequences in the ITS1-5.8S-ITS2 region were identified. Some strains showed desirable traits as biodiesel feedstock such as (i) apparent maximal doubling times of 6 h, (ii) lipids accumulation of up to 43% of their dry biomass, (iii) high ration of mono-unsaturated to poly-unsaturated fatty acids, (iv) high response to CO2 supplementation, and (v) complete sedimentation in 4 h. Data of the outdoors performance of some strains suggested they might represent valuable resources for future research towards the regional development of the technology for microalgae-based biofuels.Fil: Do Nascimento, Mauro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Ortiz Marquez, Juan César Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Sánchez Rizza, Lara. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata; ArgentinaFil: Echarte, Maria Mercedes. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata; ArgentinaFil: Curatti, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentin

Fijación biológica del nitrógeno como estrategia alternativa a la producción industrial de fertilizantes nitrogenados

La creciente aplicación de fertilizantes nitrogenados es uno de los factores clave para responder a la demanda progresiva de alimentos a nivel mundial. La reciente diversificación de la agricultura para la producción de agrobiocombustibles ha incrementado la demanda de este insumo. El proceso industrial de Harber-Bosch constituye en la actualidad la principal fuente de fertilizantes nitrogenados y consume aproximadamente el 2% de la energía mundial. En contraposición con los beneficios que la síntesis química de fertilizantes ha representado para la Humanidad, su uso desmedido en los países más desarrollados y emergentes ocasiona una diversidad de efectos detrimentales para el medioambiente. Por otra parte, los países menos desarrollados tienen acceso restringido a este insumo y sufren la baja productividad de sus cultivos.El cultivo de microalgas representa una alternativa promisoria como complemento a la agricultura para la producción de alimentos, biocombustibles y biomateriales. Sin embargo, dado el alto contenido de nitrógeno de la biomasa algal, su cultivo masivo representaría una práctica inviable si no se contemplan alternativas a la aplicación convencional de fertilizantes.La fijación biológica del nitrógeno consiste en la biosíntesis de amonio a partir del nitrógeno del aire y representa una forma natural de fertilización nitrogenada. La aplicación de bioinoculantes conteniendo bacterias fijadoras de nitrógeno se viene utilizando exitosamente desde hace décadas en el cultivo de leguminosas. La gran especificidad de esta interacción planta-bacteria limita una mayor versatilidad de los inoculantes.En nuestro laboratorio desarrollamos prototipos de inoculantes bacterianos de amplio espectro. La mayor parte de los mismos utilizan a la bacteria modelo Azotobacter vinelandii, en la cual se combinan diferentes mutaciones por medio de herramientas de ingeniería genética que contribuyen a la desviación del flujo fisiológico del nitrógeno para optimizar la excreción de amonio como fertilizante nitrogenado de óptima calidad. Estas bacterias biofertilizantes permitieron el reemplazo de una parte sustancial del fertilizante químico cuando fueron introducidas en el cultivo de microlgas hiperproductoras de aceite, como materia prima para biodiesel. En estos modelos de sistemas productivos, la energía necesaria para la fijación del nitrógeno proviene de productos de desecho ricos en energía que producen las microalgas, estableciéndose una estrecha relación funcional entre el cultivo y el inoculante.Otro desarrollo del laboratorio consiste en la obtención a bajo costo y procesamiento de biomasa de cianobacterias fijadoras de nitrógeno para la producción de un biofertilizante nitrogenado natural, el cual mejoró el rendimiento de biomasa algal en relación a los fertilizantes convencionales.En el futuro inmediato el laboratorio se dispone a la optimización de estos inoculantes y a expandir su potencial campo de aplicación a otros cultivos, incluyendo plantas de interés agronómico.Fil: Ortiz Marquez, Juan César Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Arruebarrena Di Palma, Andrés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Ambrosio, Rafael. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Inchaurrondo, Joaquín. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Curatti, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentin

Metabolic engineering of a diazotrophic bacterium improves ammonium release and biofertilization of plants and microalgae

The biological nitrogen fixation carried out by some Bacteria and Archaea is one of the most attractive alternatives to synthetic nitrogen fertilizers. However, with the exception of the symbiotic rhizobia-legumes system, progress towards a more extensive realization of this goal has been slow. In this study we manipulated the endogenous regulation of both nitrogen fixation and assimilation in the aerobic bacterium Azotobacter vinelandii. Substituting an exogenously inducible promoter for the native promoter of glutamine synthetase produced conditional lethal mutant strains unable to grow diazotrophically in the absence of the inducer. This mutant phenotype could be reverted in a double mutant strain bearing a deletion in the nifL gene that resulted in constitutive expression of nif genes and increased production of ammonium. Under GS non-inducing conditions both the single and the double mutant strains consistently released very high levels of ammonium (>20 mM) into the growth medium. The double mutant strain grew and excreted high levels of ammonium under a wider range of concentrations of the inducer than the single mutant strain. Induced mutant cells could be loaded with glutamine synthetase at different levels, which resulted in different patterns of extracellular ammonium accumulation afterwards. Inoculation of the engineered bacteria into a microalgal culture in the absence of sources of C and N other than N2 and CO2 from the air, resulted in a strong proliferation of microalgae that was suppressed upon addition of the inducer. Both single and double mutant strains also promoted growth of cucumber plants in the absence of added N-fertilizer, while this property was only marginal in the parental strain. This study provides a simple synthetic genetic circuit that might inspire engineering of optimized inoculants that efficiently channel N2 from the air into crops.Fil: Ambrosio, Rafael. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; ArgentinaFil: Ortiz Marquez, Juan César Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; ArgentinaFil: Curatti, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; Argentin

Metabolic engineering of ammonium release for nitrogen-fixing multispecies microbial cell-factories

The biological nitrogen fixation carried out by some Bacteria and Archaea is one of the most attractive alternatives to synthetic nitrogen fertilizers. In this study we compared the effect of controlling the maximum activation state of the Azotobacter vinelandii glutamine synthase by a point mutation at the active site (D49S mutation) and impairing the ammonium-dependent homeostatic control of nitrogen- fixation genes expression by the ΔnifL mutation on ammonium release by the cells. Strains bearing the single D49S mutation were more efficient ammonium producers under carbon/energy limiting conditions and sustained microalgae growth at the expense of atmospheric N2 in synthetic microalgae– bacteria consortia. Ammonium delivery by the different strains had implications for the microalga's cell-size distribution. It was uncovered an extensive cross regulation between nitrogen fixation and assimilation that extends current knowledge on this key metabolic pathway and might represent valuable hints for further improvements of versatile N2-fixing microbial-cell factories.Fil: Ortiz Marquez, Juan César Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones En Biodiversidad y Biotecnología; Argentina. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; ArgentinaFil: Do Nascimento, Mauro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones En Biodiversidad y Biotecnología; Argentina. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; ArgentinaFil: Curatti, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones En Biodiversidad y Biotecnología; Argentina. Fundación para Investigaciones Biológicas Aplicadas; Argentin

High lipid productivity of an Ankistrodesmus-Rhizobium artificial consortium

Microalgae have great potential as alternative productive platforms for sustainable production of bioenergy, food, feed and other commodities. Process optimization to realize the claimed potential often comprises strains selection and improvement and also developing of more efficient cultivation, harvesting and downstream processing technology. In this work we show that inoculation with the bacterium Rhizobium strain 10II resulted in increments of up to 30% in chlorophyll, biomass and lipids accumulation of the oleaginous microalgae Ankistrodesmus sp. strain SP2-15. Inoculated cultures have reached a high lipid productivity of up to 112 mg L(-1) d(-1) after optimization. The resulting biomass presented significant levels of Ω3 fatty acids including stearidonic acid, suggesting potential as an alternative land-based source of essential fatty acids.Fil: Do Nascimento, Mauro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Curatti, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones En Biodiversidad y Biotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Departamento de Biología Aplicada y Alimentos. Cátedra de Microbiologia Agrícola; ArgentinaFil: Dublan, María de Los Ángeles. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones En Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Ortiz Marquez, Juan César Federico. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentin