Synthesis and evaluation of selective sorbents MIP and RAMIP for the analysis of fluoroquinolones in environmental complex matrix by column-switching LC-MS/MS

A elevada introdução de antibióticos no ambiente aquático tem aumentado a preocupação em relação ao desenvolvimento de microrganismos resistentes aos agentes antimicrobianos e seu potencial impacto na biota aquática. Com o objetivo de monitorar a presença, persistência e destinação desses fármacos no meio ambiente, há a necessidade de se desenvolver métodos analíticos altamente sensíveis a baixas concentrações desses antibióticos, na ordem de ng L-1 a μg L-1. Nesse contexto o trabalho tem como objetivo a síntese de sorventes seletivos como polímeros molecularmente impressos (MIP) e polímeros molecularmente impressos com acesso restrito (RAMIP) para a análise de amostras aquosas complexas contendo fluoroquinolonas, empregando extração em fase sólida (SPE) online acoplada por column-switching (CS) à LC-MS/MS. Dois MIPs (MIP1 e MIP2) foram sintetizados utilizando ofloxacino como molécula molde, ácido metacrílico como monômero e, etileno glicol dimetacrilato (MIP1) ou trimetilpropano trimetacrilato (MIP2) como agente de ligação cruzada. O glicerol dimetacrilato e hidroximetil dimetacrilato foram utilizados para promover a formação de uma superfície hidrofílica sobre os MIP1 e MIP2 (RAMIP1 e RAMIP2). Os polímeros sintetizados (MIP1, MIP2, RAMIP1 e RAMIP2) foram acondicionados em colunas de 21,7 x 2,0 mm e empregados para análise direta das matrizes em um sistema de CS-LC-MS/MS online, para avaliação da seletividade, exclusão de macromoléculas e recuperação relativa do processo. As fases sintetizadas foram recobertas com ácidos húmicos (MIP1-AH, MIP2-AH, RAMIP1-AH, RAMIP2-AH) e foram comparadas a fase extratora HLB-AH quanto a seletividade e capacidade de exclusão de proteínas e ácidos húmicos. Os polímeros sintetizados mostraram-se seletivos para a análise de fluoroquinolonas quando comparados com possíveis interferentes, em especial o MIP1 e MIP-AH, com seletividade maior em relação à apresentada pelas fases comerciais HLB Oasis® e StrataX®. Além disso, foi possível eliminar cerca de 92-100% de proteína quando percolada uma solução aquosa de 44 mg mL-1 de albumina sérica bovina (BSA) e de 94-96% quando percolada uma solução aquosa de 6 mg mL-1 de ácido húmico. A eficiência relativa do processo de preparo de amostra apresentada pelos polímeros sintetizados foi comparável à da fase comercial, no entanto o desvio padrão relativo (DPR) apresentado pela fase HLB foi maior. O polímero MIP1-AH apresentou melhor eficiência no processo de extração para a maioria dos analitos quando analisado em matriz de esgoto preparado em laboratório e esgoto sanitário enquanto que as fases MIP2 e RAMIP1 apresentaram um melhor desempenho na extração dos analitos em matriz de efluente de ETE. Em suma, o efeito matriz mostrou-se ainda persistente devido à complexidade das matrizes avaliadas, o que foge à idealidade para que se tenha detecção de fluoroquinolonas em baixíssimas concentrações, como objetivo desse trabalho. Dessa forma, para que o método possa ser utilizado para análise de amostras reais é necessária a compatibilização das matrizes durante a validação do método.The increased use of antibiotics has led to a higher presence of these molecules into environment. Therefore, there is a raising concern on this matter, since antibiotics may yield microorganisms resistant to their effects. Aiming to monitoring the presence, persistence and destination of these drugs on the environment, there is an urge for the development of highly sensitive analytical methods, capable of detecting at the μg L-1 to the ng L-1 concentration levels. In this fashion, this thesis focuses on the synthesis of selective sorbents such as molecular imprinted polymers (MIP) and restricted access molecular imprinted polymers (RAMIP) for the analysis of complex water samples containing fluoroquinolones. Additionally, it includes the use of these sorbents by online solid phase extraction (SPE) coupled to LC-MS/MS, using a column-switching (CS) setup. Two MIPs (MIP1 and MIP2) were synthesized using ofloxacin as template, methacrylic acid as monomer and ethylene glycol dimethacrylate (MIP1) or trimethylpropane trimethacrylate (MIP2) as cross-linking agent. The glycerol dimethacrylate and hydroximethyl dimethacrylate were employed to promote the formation of a hydrophilic surface layer on MIP1 and MIP2 (RAMIP1 and RAMIP2). The synthesized polymers (MIP1, MIP2, RAMIP1, RAMIP2) were packed into 21,7 x 2,0 mm columns and used for the direct analysis of complex water matrices using an online CS-LC-MS/MS system, for the evaluation of the selectivity, macromolecules exclusion and relative process efficiency. The synthesized phases were coated with humic acids (MIP1-AH, MIP2-AH, RAMIP1-AH, RAMIP2-AH) and were compared to the extraction phase HLB-AH regarding its selectivity and capability of proteins and humic acid exclusion. The synthesized polymers displayed selectivity for the analysis of fluoroquionolones when compared to the possible interferents, specially the MIP1 and MIP1-AH, with a higher selectivity when compared with the commercial phases Oasis® HLB and Strata X®. Additionally, when percolating an aqueous solution containing 44 mg mL-1 of bovine seric albumin (BSA) it was possible to eliminate ca. 92-100% of the proteins and 94-96% of exclusion was obtained when percolating an aqueous solution containing 6 mg mL-1 of humic acid. The relative process efficiency of sample preparation resulted from the synthesized polymers was comparable to that of the commercial phase, however the relative standard deviation (RSD) for the HLB phase was higher. The polymer MIP1-AH displayed better efficiency for the extraction process for most of the analytes on both sewage matrices, the one prepared on the laboratory and the sanitary one. The phases MIP2 and RAMIP1 presented a better performance for the extraction of analytes in effluents of a wastewater treatment plant. In conclusion, the matrix effect showed to be a persistent effect, given the complexity of the matrices analyzed. This fact is far from an ideal condition of detecting fluoroquinolones in real-life application where they are present at very low concentrations. In this sense, for the application of this method for real samples, a strategy of matrix matching would be needed during the validation of the method

Determination of statins in human plasma using microextraction in packed syringe (MEPS) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

As elevadas taxas de colesterol plasmático representam um grande risco à saúde, uma vez que podem causar doenças cardiovasculares. Para o tratamento e prevenção da dislipidemia são utilizados medicamentos reguladores do colesterol, como as estatinas. Embora eficazes e extensamente utilizados, esses fármacos apresentam efeitos adversos se administrados na dosagem errada. Assim, faz-se necessário o desenvolvimento de um método de monitorização terapêutica a fim de se ajustar a concentração desses compostos no sangue. Este trabalho visa o desenvolvimento de um método para análise de pravastatina (PRA), atorvastatina (AT), fluvastatina (FLV) e sinvastatina (SV) em plasma humano usando cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). Na etapa de preparo de amostras, de forma inédita, utilizou-se a técnica microextração por sorvente empacotado (MEPS) para a análise de plasma humano contendo quatro estatinas. Para a otimização das condições de extração avaliaram-se, por experimentos univariados, parâmetros como fase extratora, composição do solvente de eluição e de lavagem. Outros fatores como volume de amostra, ciclos de amostragem, ciclos de eluição e etapas de eluição foram avaliados empregando-se planejamento experimental multivariado. A extração foi realizada utilizando-se uma fase estacionária C18 Chromabond como sorvente. O método MEPS-LC-MS/MS desenvolvido foi validado baseando-se nas recomendações da agência nacional de vigilância sanitária (ANVISA) e apresentou linearidade, seletividade, precisão, exatidão e recuperação adequadas para as estatinas, excetuando-se para a sinvastatina. A faixa de linearidade obtida foi de 10-200 ng mL-1 (FLV e AT) e 20-200 ng mL-1 (PRA). Os limites de quantificação obtidos foram da ordem de 10 ng mL-1 (AT e FLV) e 20 ng mL-1 (PRA). Desta forma o método desenvolvido poderá ser utilizado para a determinação dos níveis de pravastatina, fluvastatina e atorvastatina em amostras de plasma humano.Elevated plasma cholesterol level is a risk factor for coronary diseases, which are the most deadly sickness according to the World Health Organization (WHO). In order to fight the hypercholesterolemia in patients, statins are a well-established class of drugs to be prescribed. Even though they are efficient, some side effects can be associated with statin therapy, especially when interactions with other drugs occur. In these cases, monitoring the concentration can optimize the drug dosage to therapeutic effectiveness whilst minimizing the adverse effects. The aim of this work was to develop a method for analysis of pravastatin (PRA), atorvastatin (AT), fluvastatin (FLV) and simvastatin (SV) in human plasma. The experimental means chosen to attain the goal was liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and for the sample preparation, microextraction by packed sorbent (MEPS). To optimize the extraction conditions, parameters such as sorbent, elution and washing solution were evaluated. Other parameters such as sampling, elution cycles, sample volume and elution steps were evaluated using multivariate experimental design. The extraction was performed using C18 Chromabond as sorbent. The method was validated based on ANVISA recommendations and featured appropriated linearity, selectivity, accuracy, precision, and recovery, except for simvastatin. The calibration curve in plasma was obtained in the concentration range 10-200 ng mL-1 (FLV and AT) and 20-200 ng mL-1 (PRA) and the limit of quantification (LOQ) was 10 ng mL-1 (FLV and AT) and 20 ng mL-1 (PRA). The method developed proved to be suitable for the analysis of pravastatin, fluvastatin and atorvastatin in human plasma sample, but not simvastatin, and it can contribute to a more efficient usage of the statins in the treatment of hypercholesterolemia

Isolation of brazilian marine fungi capable of growing on DDD pesticide

The fungi Aspergillus sydowii Ce15, Aspergillus sydowii Ce19, Aspergillus sydowii Gc12, Bionectria sp. Ce5, Penicillium miczynskii Gc5, Penicillium raistrickii Ce16 and Trichoderma sp. Gc1, isolated from marine sponges Geodia corticostylifera and Chelonaplysylla erecta, were evaluated for their ability to grow in the presence of DDD pesticide. Increasing concentrations of DDD pesticide, i.e., 5.0 mg (1.56 × 10−12 mmol), 10.0 mg (3.12 × 10−2 mmol) and 15.0 mg (4.68 × 10−2 mmol) in solid and liquid culture media were tested. The fungi Trichoderma sp. Gc1 and Penicillium miczynskii Gc5 were able to grow in the presence of up to 15.0 mg of DDD, suggesting their potential for biodegradation. A 100% degradation of DDD was attained in liquid culture medium when Trichoderma sp. Gc1 was previously cultivated for 5 days and supplemented with 5.0 mg of DDD in the presence of hydrogen peroxide. However, the quantitative analysis showed that DDD was accumulated on mycelium and biodegradation level reached a maximum value of 58% after 14 days224350CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQFUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP307830/2006-32006/54401-2; 2007/58263-

Isolation of Brazilian marine fungi capable of growing on DDD pesticide

The fungi Aspergillus sydowii Ce15, Aspergillus sydowii Ce19, Aspergillus sydowii Gc12, Bionectria sp. Ce5, Penicillium miczynskii Gc5, Penicillium raistrickii Ce16 and Trichoderma sp. Gc1, isolated from marine sponges Geodia corticostylifera and Chelonaplysylla erecta, were evaluated for their ability to grow in the presence of DDD pesticide. Increasing concentrations of DDD pesticide, i.e., 5.0 mg (1.56 x 10(-12) mmol), 10.0 mg (3.12 x 10(-2) mmol) and 15.0 mg (4.68 x 10(-2) mmol) in solid and liquid culture media were tested. The fungi Trichoderma sp. Gc1 and Penicillium miczynskii Gc5 were able to grow in the presence of up to 15.0 mg of DDD, suggesting their potential for biodegradation. A 100% degradation of DDD was attained in liquid culture medium when Trichoderma sp. Gc1 was previously cultivated for 5 days and supplemented with 5.0 mg of DDD in the presence of hydrogen peroxide. However, the quantitative analysis showed that DDD was accumulated on mycelium and biodegradation level reached a maximum value of 58% after 14 days.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)FAPESP[2006/54401-2]FAPESP[2007/58263-6]Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)CNPq[307830/2006-3]Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq