A practical review on the measurement tools for cellular adhesion force

Cell cell and cell matrix adhesions are fundamental in all multicellular organisms. They play a key role in cellular growth, differentiation, pattern formation and migration. Cell-cell adhesion is substantial in the immune response, pathogen host interactions, and tumor development. The success of tissue engineering and stem cell implantations strongly depends on the fine control of live cell adhesion on the surface of natural or biomimetic scaffolds. Therefore, the quantitative and precise measurement of the adhesion strength of living cells is critical, not only in basic research but in modern technologies, too. Several techniques have been developed or are under development to quantify cell adhesion. All of them have their pros and cons, which has to be carefully considered before the experiments and interpretation of the recorded data. Current review provides a guide to choose the appropriate technique to answer a specific biological question or to complete a biomedical test by measuring cell adhesion

Optical waveguide-based biosensor for label-free monitoring of living cells

Here, we briefly discuss the past, present, and possible future of label-free optical biosensors in cell research, especially focusing on the kinetic monitoring of cellular adhesion. Currently available optical biosensors possess outstanding potentials still not rightfully recognized and still waiting to be fully exploited in the field of cell science. Thus, during the description we give special emphasis to the advantages that the state-of-the-art optical cell-based biosensors possess as compared to microscope- or force measurement-based techniques widely used to characterize cell adhesion. To name here only a few, they enable label-free detection close to a planar sensor surface, have high sensitivity, and generate superior quality kinetic data. Such information-rich kinetic data, in turn, can be analyzed in-depth and comparatively. To exemplify the importance of in-depth kinetic analysis, we review a recent study, in which the Epic BenchTop high-throughput optical biosensor was used to measure the dependence of cancer cell adhesion kinetics on the surface density of integrin ligands. Based on the kinetic data, a model enabling the label-free determination of the dissociation constant of the adhesion ligands bound to their native cell membrane receptors has been constructed. As an outlook, the perspectives of the technology is briefly discussed

ÉLŐ SEJTEK ADHÉZIÓJÁNAK MONITOROZÁSA OPTIKAI BIOSZENZOROKKAL

Egy újszerű, nagy áteresztőképességű optikai bioszenzor, az Epic BenchTop (BT) segítségével azt vizsgáltuk, hogyan függ a rákos sejtek kiterülésének kinetikája a integrin-ligandum RGD-motívumok átlagos felületi sűrűségétől (νRGD) [1]. A biologiallag inaktív PLL-g-PEG kopolimer, és az RGD-funkcionalizált PLL-g-PEG-RGD vegyített oldatait használtuk a felületi bevonatok elkészítéséhez, νRGD-t négy nagységrenden keresztül hangoltuk. Modell sejtvonalként az erősen adherens HeLa rákos sejtvonalat használtuk, a kiterülés kinetikáját az Epic BT bioszenzorral egyedülálló minőségben rögzítettük. A kapott görbéket kinetikai elemzésnek vetettük alá: az adatokat a logisztikus egyenlettel illesztettük meg, hogy meghatározhassuk, hogyan függ a felületi ligandsúrúségtől a sejtkiterülés sebességi állandója (r), illetve a maximális bioszenzor jel (∆λmax). Eredményeink szerint r nem függ νRGD-től, átlagos értéke 0.062±0.004 min-1. Ezzel szemben ∆λmax, ami egyenesen arányos a kiterült sejt átlagos kontaktterületével, növekedett, ahogy νRGD-t növeltük. Ezt a viselkedést egy egyszerű monovalens kötési reakcióval leírva meghatároztuk a PLL-PEG-RGD molekula RGD-motívuma és a sejt integrinjei közötti kölcsönhatás két dimenziós disszociációs állandóját, mely 1753 μm-2-nek adódott. Ebből egyszerűen származtatható a kapcsolat 3D-s disszociációs állandója, melynek értéke ~30 μM. Mindezen eredményehez egyedülló módon teljesen noninvazív és jelölésmentes kísérleteken keresztül jutottunk

Jelölésmentes optikai bioszenzorok a sejtadhézió vizsgálatában

A sejtadhézió kulcsfontosságú biológiai jelenség, melynek során egy sejt specifikus receptor-ligandum kapcsolatokon keresztül önmagát egy megfelelő aljzatra vagy másik sejtre kihorgonyozva, sejtvázát aktívan átszervezve kiterül, és felveszi a sejttípusra jellemző morfológiát. Fundamentális jelentőségénél fogva a sejtadhézió minél részletesebb leírása és megértése számos interdiszciplináris tudományág, így például a biofizika, gyógyszertan, vagy az orvos- és anyagtudomány egyik alapvető célja és érdeke. Mindennek ellenére a legtöbb, a területen alkalmazott vizsgálati technika az eredendően dinamikus természetű adhéziót egyetlen időpillanatban vagy rossz időbeli felbontással, tehát hiányosan és szegényesen képes csak karakterizálni. Kivételt képeznek ez alól a jelölésmentes bioszenzorok, melyek felületközeli folyamatok kinetikájának kvázi perturbációmentes követését teszik lehetővé. A sejtadhézió vizsgálatára különösen alkalmasnak bizonyultak az evaneszcens tér-alapú optikai bioszenzorok, mivel i) kizárólag a folyamat szempontjából legrelevánsabb, a tapadási felületként szolgáló sík szenzorhoz legközelebbi ~150 nm-es tartományban érzékenyek, illetve ii) jelük egy integrált jel, mely nem csak az átlagos kontaktterülettől, hanem az azon belüli optikai sűrűségtől is függ, így az adhézió mértékének kiváló mérőszámaként használható. Az újszerű Epic BenchTop nagy áteresztőképességű optikai bioszenzort [1] az elsők között használtuk a sejtahézió tanulmányozására. Első ízben HeLa sejtek adhéziós kinetikájának az adhéziós ligandok felületi sűrűségétől való függését vizsgáltuk. A kiváló minőségű adatokat kinetikai elemzésnek alávetve megállapítottuk, hogy a folyamat sebességi állandója nem függ a ligandsűrűségtől, az adhézió mértéke viszont igen. Az adhéziós receptorok és a ligandum közötti kölcsönhatást egyszerű monovalens kötési folyamatként modelleztük, és az utóbbi adatokat megillesztve meghatároztuk a receptor-ligandum kölcsönhatás disszociációs állandóját. Ez 30 μM-nak adódott, melyet irodalmi adatokkal összevetve reális értéknek találtunk [2]. Bár számos esetben a sejtadhézió kinetikája leírható egy szimmetrikus szigmoiddal, egyre több eredményünk mutat abba az irányba, hogy felületkémiai módosítások vagy egyes kis molekulás hatóanyagokkal történő kezelések hatására a sejtadhézió nem triviális, esetenként pedig még csak nem is monoton kinetikát követ. Mindez tovább hangsúlyozza, hogy a kinetikai adatrögíztés mindenféle sejtes kísérletben alapvető fontosságú lehet

Bulk and surface sensitivity of a resonant waveguide grating imager

We report the assessment of the sensitivity of a microplate-compatible resonant waveguide grating imager. The sensitivity to bulk refractive index changes was determined using a serial dilution of glycerol solution with the help of a refractometer. The surface sensitivity was examined using layer-by-layer polyelectrolyte films in conjunction with optical waveguide lightmode spectroscopy and characterized by the binding of acetazolamide to immobilized carbonic anhydrase under microfluidics. The results suggest that the imager has a limit of detection down to 2.2 × 10−6 for refractive index change and 0.078 ng/cm2 for the adsorbed mass. © 2014 AIP Publishing LL

Egyedi sejtek adhéziós vizsgálata számítógép- vezérelt mikropipettával

A leukociták adhéziója a specifikus makromolekulákhoz fontos feladat az immunválasz elindításában. Azonban az egyedi sejtek direkt adhéziós erejének meghatározása még napjainkban is kihívást jelent, hiszen az erre alkalmas technikák rendkívül alacsony áteresztőképességűek (5-10 sejt/nap). Egy inverz mikroszkópra felszerelt számítógép- vezérelt mikropipetta technikával egyedi humán fehérvérsejtek és specifikus makromolekulák kölcsönhatását tanulmányoztuk. A felülethez tapadt sejtek adhéziós ereje pontosan meghatározható a sejtválogatási folyamat ismétlésével, egyre növekvő vákuumot alkalmazva a sejt felett elhelyezkedő mikropipettában. Ezzel a módszerrel több száz sejt vizsgálható egyenként, viszonylag rövid idő alatt (~30 perc). Kísérleteink során a nem specifikus sejtadhéziót PLL-g-PEG polimerrel blokkoltuk. Azt tapasztaltuk, hogy a primer monociták kevésbé adherensek a fibrinogén felületen, mint az in vitro differenciáltatott származékai: a makrofágok és dendritikus sejtek, az utóbbiak mutatták a legmagasabb adhéziós erőt. Megvizsgáltuk a CD11b/CD18 (αMβ2) és CD11c/CD18 (αXβ2) integrinek hozzájárulását a fent említett 3 sejttípus adhéziójára. A CD11b/CD18 integrin meglepő gátló hatását észleltük a sejtadhézión

Automated single cell isolation from suspension with computer vision

Current robots can manipulate only surface-attached cells seriously limiting the fields of their application for single cell handling. We developed a computer vision-based robot applying a motorized microscope and micropipette to recognize and gently isolate intact individual cells for subsequent analysis, e.g., DNA/RNA sequencing in 1–2 nanoliters from a thin (~100 μm) layer of cell suspension. It can retrieve rare cells, needs minimal sample preparation, and can be applied for virtually any tissue cell type. Combination of 1 μm positioning precision, adaptive cell targeting and below 1 nl liquid handling precision resulted in an unprecedented accuracy and efficiency in robotic single cell isolation. Single cells were injected either into the wells of a miniature plate with a sorting speed of 3 cells/min or into standard PCR tubes with 2 cells/min. We could isolate labeled cells also from dense cultures containing ~1,000 times more unlabeled cells by the successive application of the sorting process. We compared the efficiency of our method to that of single cell entrapment in microwells and subsequent sorting with the automated micropipette: the recovery rate of single cells was greatly improved

Élő sejtek adhéziójának monitorozása nagy áteresztőképességű jelölésmentes optikai bioszenzorral

A biológiailag kulcsfontosságú sejtadhézió természeténél fogva dinamikus folyamat, ennek ellenére a karakterizálására használt jelenlegi technikák többsége vagy nagyon rossz időbeli felbontással rendelkezik, vagy csak végponti információt képes szolgáltatni. Vizsgálatainkat éppen ezért egy jelölésmentes optikai bioszenzoron, a kiváló időbeli felbontással és nagy áteresztőképességgel rendelkező Epic BT műszeren végeztük [1]. Első ízben HeLa sejtek adhéziós kinetikájának az adhéziós ligandok felületi sűrűségétől való függését vizsgáltuk. A kiváló minőségű adatokat kinetikai elemzésnek vetettük alá. Ezt követően az adhéziós receptorok és a ligandum közötti kölcsönhatást egyszerű monovalens kötési folyamatként modelleztük, és meghatároztuk a kölcsönhatás disszociációs állandóját [2]. Bár számos esetben a sejtadhézió időbeli fejlődése leírható egy szimmetrikus szigmoiddal, egyre több eredményünk mutat abba az irányba, hogy a folyamat ettől eltérő kinetikát is követhet. Egyes felületkémiai módosítások vagy bizonyos kis molekulás hatóanyagokkal történő kezelések hatására rákos sejtek nem triviális kinetikával terültek ki. Humán primer immunsejtekkel végzett kísérleteinkben az adhéziós jel egy óra után kezelés hiányában is feltűnően lecsengett, nem monoton kinetika szerint alakult. Ezen eredményeink tovább hangsúlyozzák a kinetikai adatrögzítés alapvető fontosságát mindennemű sejtes vizsgálatban. [1] N. Orgovan et al., Appl. Phys. Lett., vol. 104, no. 8, p. 083506, Feb. 2014. [2] N. Orgovan et al., Sci. Rep., vol. 4, p. 4034, Jan. 2014

Functional differences between human CR3 (CD11b/CD18) and CR4 (CD11c/CD18): CD11b dominates iC3b mediated phagocytosis, while CD11c prevails adherence

Complement receptors CR3 (CD11b/CD18) and CR4 (CD11c/CD18) belong to the family of beta2 integrins and are expressed by several, mainly myeloid cell types in humans. Their function is to mediate iC3b opsonized phagocytosis and adherence to ICAM-1 and fibrinogen. These functions were so far analysed under experimental conditions, where the contribution of CD11b/CD18 and CD11c/CD18 could not be separated. Although very little is known about the features of CR4, it is supposed that the two integrins exert similar functions, since they bind the same ligands. From an evolutionary aspect however it does not seem rewarding to maintain two receptors with similar ligand specificity for the same functions. Therefore our goal is to reveal what separate functions might be exerted by CR3 and CR4 We used both classical and high throughput label free optical biosensor and single cell analysis methods to decipher the distinct role of CD11c. Previously we demonstrated that on human monocyte-derived dendritic cells (MDCs) CD11b is responsible for iC3b mediated phagocytosis, while CD11c is dispensable. In our recent work we analysed how CD11b and CD11c participate in adherence to their ligands. We employed human monocytes, monocyte-derived macrophages (MDMs) and MDCs which highly express CR3 and CR4 and adherence is their natural property. First we determined the exact number of CD11b and CD11c on these cell types by a bead based technique, and found that the ratio of CD11b/CD11c is 1.2 for MDCs, 1.7 for MDMs and 7.1 for monocytes, suggesting that CD11c is most important for MDCs and less for monocytes. By analyzing the kinetics and force of adherence of the different cell types to immobilized fibrinogen ligand, we found that attachment of MDCs is stronger than that of monocytes. Using antibody blocking and RNA silencing techniques we proved that adherence to fibrinogen – the common ligand of CR3 and CR4 – is mediated by CD11c. When we previously analyzed iC3b mediated phagocytosis, we found that blocking CD11c does not impair this function. In contrast to this, in the case of adherence, we found that blocking CD11b even enhances attachment to fibrinogen, suggesting a competition between CD11b and CD11c for this ligand

Automated single cell sorting and deposition in submicroliter drops

Automated manipulation and sorting of single cells are challenging, when intact cells are needed for further investigations, e.g., RNA or DNA sequencing. We applied a computer controlled micropipette on a microscope admitting 80 PCR (Polymerase Chain Reaction) tubes to be filled with single cells in a cycle. Due to the Laplace pressure, fluid starts to flow out from the micropipette only above a critical pressure preventing the precise control of drop volume in the submicroliter range. We found an anomalous pressure additive to the Laplace pressure that we attribute to the evaporation of the drop. We have overcome the problem of the critical dropping pressure with sequentially operated fast fluidic valves timed with a millisecond precision. Minimum drop volume was 0.4-0.7 μl with a sorting speed of 15-20 s per cell. After picking NE-4C neuroectodermal mouse stem cells and human primary monocytes from a standard plastic Petri dish we could gently deposit single cells inside tiny drops. 94 ± 3% and 54 ± 7% of the deposited drops contained single cells for NE-4C and monocytes, respectively. 7.5 ± 4% of the drops contained multiple cells in case of monocytes. Remaining drops were empty. Number of cells deposited in a drop could be documented by imaging the Petri dish before and after sorting. We tuned the adhesion force of cells to make the manipulation successful without the application of microstructures for trapping cells on the surface. We propose that our straightforward and flexible setup opens an avenue for single cell isolation, critically needed for the rapidly growing field of single cell biology. © 2014 AIP Publishing LLC