Performance of poly ?-caprolactone / poly (rotaxane) disks functionalized with human dental pulp stem cells in angiogenesis: a chorioallantoic membrane assay

As terapias regenerativas abrem grandes possibilidades para as grandes reconstruções ósseas. A engenharia de biomateriais tem um papel importante nesse cenário, mais precisamente com o desenvolvimento de estruturas que forneçam um ambiente favorável para a proliferação e diferenciação de células residentes ou implantadas na região receptora para a neoformação óssea. Há seis anos trabalhamos em parceria com o Departamento de Materiais da Faculdade de Engenharia Mecânica da UNICAMP para a caracterização biológica de um biomaterial composto por uma blenda polimérica de poli ?-caprolactona/poli (rotaxano), que apresentou potencial para ser funcionalizada por células tronco de polpa dentária humana com diferenciação osteogênica. O sucesso da bioengenharia de substitutos de novos tecidos depende de rápida e adequada angiogênese para que ocorra suprimento de oxigênio e de nutrientes para a sobrevida das células. O objetivo deste estudo foi verificar o desempenho de discos de blenda polimérica de poli ?-caprolactona/poli (rotaxano) funcionalizados por células tronco de polpa dentária humana no processo de vascularização por meio de um ensaio em membrana corioalantóica. Células tronco de polpa dentária humana (hDPSCs) foram cultivadas por 14 dias a partir de amostras congeladas e re-caracterizadas. Para este ensaio, utilizamos ovos de galinha fertilizados no 3º dia embrionário. Foram removidos 2mL de albumina e a confeccionada abertura nas cascas de todos os ovos. No 7º dia embrionário sobre a membrana corioalantóica (MCA) dos ovos que apresentavam sinal visível de fecundação e embrião viável, foram depositados os insertos do experimento distribuídos nos grupos: Policlono, onde as células cultivadas em meio clonogênico por 14 dias foram semeadas sobre discos do polímero; Polimin, onde as células semeadas foram cultivadas em meio mineralizante por 14 dias; Poli no qual foi inserido apenas o disco de polímero sem semeadura celular; controle positivo apenas com inserto de hDPSCs na mesma densidade das semeaduras anteriores e controle negativo sem células e sem biomaterial para normatizar o padrão vascular sem intervenções. No 14º dia embrionário as aberturas nas cascas foram ampliadas e foram realizadas imagens digitais padronizadas para avaliação macroscópica da vascularização. As MCAs de todos os ovos foram removidas para análise histológica por meio de coloração por Hematoxilina-Eosina para avaliação microscópica da angiogênese. Colorações imuno-histoquímicas para anticorpos CD34 e Actina músculo liso (AML) e de imunofluorescência para Lamin-A foram utilizadas de foram representativas da presença das células endoteliais, dos vasos sanguíneos e das hDPSCs respectivamente. Os resultados mostraram que ocorreu aumento do número de vasos e intersecções e uma correspondência histológica da angiogênese na presença do conjunto poli ?-caprolactona/poli (rotaxano)/hDPSCs. Foi possível observar ainda que as células indiferenciadas pareceram estimular a angiogênese de forma mais intensa quando comparado às células diferenciadas. A blenda de poli ?-caprolactona/poli (rotaxano) possui potencial de estimular a angiogênese especialmente quando funcionalizada por células tronco e desempenho promissor como biomaterial bioativo para bioengenharia nas terapias regenerativas.Regenerative therapies open great possibilities for large bone reconstructions. Biomaterial engineering plays an important role in this scenario, more precisely with the development of structures that provide a favorable environment for the proliferation and differentiation of cells residents or implanted in a receptor region for bone neoformation. For six years, we have been working in partnership with the Materials Department of the Faculty of Mechanical Engineering of UNICAMP for the biological characterization of a biomaterial composed of a polymeric blend of poly ?caprolactone/poly (rotaxane), which presented the potential to be functionalized by human dental pulp stem cells and osteogenic differentiation. The success of bioengineering of new tissue substitutes depends on rapid and adequate angiogenesis for the supply of oxygen and nutrients for cell survival. The objective of this study was to verify the performance of polymeric blend discs of poly ?caprolactone/poly (rotaxane) functionalized by human dental pulp stem cells in the vascularization process by means of a chorioallantoic membrane assay. Human dental pulp stem cells (hDPSCs) were cultured for 14 days from frozen and recharacterized samples. For this trial, on the 3rd embryonic day of fertilized chicken eggs, 2mL of albumin was removed and the opening was made in the shells of all eggs. On the 7th embryonic day on the chorioallantoic membrane (MCA) of the eggs that presented visible sign of fertilization and viable embryo, the inserts of the experiment were deposited in the groups: Polyclon- where the cells cultivated in clonogenic medium for 14 days were sown on polymer discs; Polimin- where the seed cells were grown in mineralizing medium for 14 days; Poly - where only the polymer disc without cell sowing was inserted; positive control where hDPSCs were inserted the same density of the previous groups and, negative controlwithout cells or biomaterial, to standardize the vascular pattern without interventions. On the 14th embryonic day, the openings in the barks were enlarged and standardized digital images were performed for macroscopic evaluation of vascularization. The MCAs of all eggs were removed for histological analysis by hematoxylin-eosin staining for microscopic evaluation of angiogenesis. Immunohistochemical staining for CD34 and Actin smooth muscle (AML) and immunofluorescence for Lamin-A antibodies were used to be representative of the presence of endothelial cells, blood vessels and hDPSCs, respectively. The results showed that there was an increase in the number of vessels and intersections and a histological correspondence of angiogenesis in the presence of the poly ?caprolactone/poly (rotaxane)/hDPSCs. It was also possible to observe that the undifferentiated cells seemed to stimulate angiogenesis more intensely when compared to the differentiated cells. The blend of poly ?-caprolactone/poly (rotaxane) have the potential to stimulate angiogenesis especially when functionalized by stem cells and shows a promising performance as bioactive biomaterial for bioengineering in regenerative therapies

Assessment of the feasibility, proliferation and osteogenic potential of stem cells from human dental pulp cultured on poly £-caprolactone / poly (rotaxane) membranes

A busca por um material de enxertia que se adapte às necessidades do cirurgião bucomaxilofacial e também que proporcione ao paciente retorno de sua função com menores danos possíveis, tem sido incessante. O enxerto autógeno é ainda hoje considerado padrão ouro devido suas propriedades, porém, ele apresenta algumas desvantagens, sendo que as maiorias de suas complicações estão associadas ao leito doador. Atualmente, a engenharia de biomateriais trabalha com o desenvolvimento de novos materiais e recursos principalmente na área de regeneração tecidual. Neste contexto, scaffolds de origem natural ou sintética com o propósito de promover a regeneração de tecidos tem sido amplamente estudados. O objetivo desse estudo foi avaliar in vitro o comportamento biológico quanto à viabilidade, proliferação celular, adesão e potencial de diferenciação de células tronco de polpa dentária humana cultivadas sobre amostras de scaffold composto por uma nova blenda de poli ?-caprolactona/poli (rotaxano). Células tronco de polpa dentária de molares humanos (hDPSCs) foram cultivadas a partir de amostras congeladas e re-caracterizadas. As células foram semeadas sobre amostras dos scaffolds e sob lamínulas de vidro e cultivadas em diferentes meios: clonogênico, mineralizante e condicionado pelo extrato do biomaterial por 1,3,7,14 e 21 dias. Foram avaliadas as curvas de crescimento e viabilidade celulares, a atividade de fosfatase alcalina, a formação de nódulos de mineralização. A adesão celular foi observada por microscopia eletrônica de varredura até o cultivo de 7 dias. Os scaffolds eram lisos, flexíveis e mostraram-se anfifílicos com características físicas de fibras dispostas aleatoriamente e poros interconectados com diâmetro médio de 13,5?m e abertura com área média de 87,14µm2. As hDPSCs expressaram níveis típicos de marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais. Não houve inibição de crescimento celular na interface com o biomaterial. As curvas de crescimento e viabilidade mostraram-se mais significativas (p<0.01), especialmente em 7 dias, para as culturas sobre os scaffolds em meio clonogênico. Resultados semelhantes foram observados com o meio mineralizante (p<0.05). Houve maior formação de nódulos de mineralização nas culturas com a presença dos scaffolds, ou seja, o biomaterial estimulou a diferenciação celular. Em microscopia eletrônica de varredura as células mostraram-se aderidas até o período de 7 dias com formação de lençóis sobre os scaffolds. A blenda de poli £-caprolactona/poli (rotaxano) apresentou biocompatibilidade in vitro, revelando aspectos promissores de serem funcionalizadas por células tronco derivadas de polpa dentária humana com potencial de uso como biomaterial bioativo para bioengenharia de tecido ósseo.The search for a graft material that provides patient with rehabilitation with little damage and also suits maxillofacial surgeon needs has been incessant. Autogenous bone is still considered the gold standard for grafting because of its properties, although it has some disadvantages and the majority of its complications are associated with the donor site. Currently, bioengineering develops new materials and resources primarily for tissue regeneration area. In this context, scaffolds of natural or synthetic origin with the purpose of promoting tissue regeneration have been widely studied. The aim of this study was to evaluate in vitro biological behavior as viability, cell proliferation, adhesion and potential of stem cell differentiation of human dental pulp grown on scaffold samples composed of a new blend of poly £-caprolactone/poly(rotaxano). Dental pulp stem cells obtained from human molars (hDPSCs) were grown from frozen samples and re-characterized. Cells were seeded onto scaffolds samples or glass coverslips and cultured in different media: clonogenic, mineralizing and conditioned by the biomaterial extract per 1,3,7,14 and 21 days. Cells growth curves and viability, alkaline phosphatase activity, formation of mineralized nodules were assessed. Cell adhesion was observed by scanning electron microscopy up to 7 days cultures. Scaffolds were flat, flexible and proved to be amphiphilic with physical characteristics of randomly arranged fibers and pores interconnected with an average diameter of 13,5?m and aperture average area of 87,14µm2. The hDPSCs expressed typical levels of mesenchymal stem cell surface markers. There was no inhibition of cell growth at the biomaterial interface. The growth rates and viability were more significant (p <0.01), especially in 7 days, to cultures over scaffolds in clonogenic medium. Similar results were observed with the mineralizing medium (p <0.05). There formation of mineralized nodules was increased in the cultures in the presence of scaffolds, in other words, the biomaterial stimulated cell differentiation. In scanning electron microscopy the cells were shown to be attached until 7-day period with formation of sheets over the scaffolds. The blend of poly ?-caprolactone/poly(rotaxano) shows biocompatibility in vitro, revealing promising aspects to be functionalized by stem cells derived from human dental pulp with potential to be used as bioactive biomaterials for bone tissue bioengineering

Can porous polymeric scaffolds be functionalized by stem cells leading to osteogenic differentiation? a systematic review of in vitro studies

The aim of this study was to analyze the influence of nanoporous structure of polymeric biomaterials on the in vitro osteogenic induction of human stem cells. An electronic search in three databases (MEDLINE, SCOPUS, and Web of Science) was performed for articles that were published before May 2018. In vitro studies were included if they met the following criteria: (1) the use of polymeric scaffolds (natural or synthetic); (2) the co-culture of human stem cells with the scaffold; and (3) cell viability, proliferation, and osteogenic differentiation assays. The main characteristics of the published studies were summarized, and a quality assessment tool was used to analyze methodological features. Eighty-eight potential articles were firstly retrieved. Thirteen were eligible for qualitative analysis. Only three studies characterized cell stemness. Nanostructure of the scaffolds showed a significant influence on viability, proliferation, and osteogenic differentiation of human stem cells. Combination of porosity between 72 and 93% and a large range diameter between 50 and 224 μm resulted in more remarkable cellular proliferation and differentiation. Porous polymeric scaffolds can be functionalized by stem cells leading to osteogenic induction. High standards of laboratory practice and accurate methodological reporting are essential for the credibility of the results157571576

In vitro and in vivo evaluation of electrospun membranes of poly (ε-caprolactone) and poly (rotaxane)

Sem informação77912919CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQCOORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPESFUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP308660/2015-3; 401297/2014-41995535/15055-