Avaliação da citotoxicidade de moduladores da neurotransmissão glutamatérgica, atorvastatina e guanosina, em células de glioma humano A172

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017.Gliomas são tumores altamente agressivos e malignos, de ocorrência no Sistema Nervoso Central. As baixas taxas de sobrevida são relacionadas à alta capacidade proliferativa, migratória e invasiva e consequente resistência a drogas. Dentre os fármacos mais utilizados está a Temozolomida (TMZ). A TMZ é um agente alquilante, eficaz na terapia de diversas neoplasias, entretanto mecanismos de resistência a esse composto acarretam em prognósticos ruins. Assim, o estudo de compostos citotóxicos é substancialmente importante para compreender os mecanismos da doença e o estudo de novas terapias. A Guanosina (GUO) e a Atorvastatina (ATOR) já demonstraram ter potencial modulatório sobre o sistema glutamatérgico. Sendo este um sistema importante no desenvolvimento dos gliomas, compostos que o modulem podem ter potencial citotóxico sobre as células de glioma. Dessa maneira, investigou-se: 1. O potencial citotóxico da ATOR em células de glioma A172 e o efeito desta em processos do desenvolvimento do glioma; 2. O potencial citotóxico da GUO em células de glioma A172, o efeito dela nos processos de desenvolvimento do glioma e mecanismos envolvidos nesse efeito. Os resultados revelam que a ATOR apresenta efeito citotóxico às células de glioma, ainda, ATOR não apresenta efeito citotóxico a astrócitos em concentração similar. ATOR reduz a migração e a proliferação celular do glioma. ATOR induz aumento nos níveis de apoptose e a co-incubação com TMZ acarreta em uma potenciação deste efeito. A ATOR aumenta a presença de organelas vesiculares ácidas, indicando aumento da autofagia. Além disso, a inibição de receptores de glutamato foi capaz de prevenir parcialmente o efeito citotóxico da ATOR, demonstrando uma possível interação desta estatina com tais receptores na indução do efeito citotóxico. A GUO também demonstrou efeito citotóxico e redução da migração das células de glioma nos mesmos níveis que a TMZ. GUO reduziu a proliferação celular em células de glioma. GUO não alterou os níveis de apoptose, contudo a co-incubação com TMZ mostrou um efeito sinérgico. Esta sinergia foi também observada na diminuição do potencial de membrana mitocondrial e na indução de dano ao DNA. O aumento da liberação de glutamato observado por TMZ foi prevenido com a co-incubação com GUO. A inibição dos receptores de adenosina A1 ou A2A levou a um bloqueio parcial do efeito citotóxico da GUO. Assim sendo, esta tese contribuiu para demonstrar o efeito antitumoral da ATOR e da GUO, bem como elucidar alguns dos mecanismos de ação envolvidos neste efeito.Abstract : Gliomas are a group of tumors considered the most aggressive and malignant type, occurring in the Central Nervous System. Low patients overall survival rates are related to high proliferative, migratory and invasive behavior of these cells and drug resistance. Among the drugs most used to treat this disease is Temozolomide (TMZ). TMZ is an alkylant agent that demonstrated efficacy on several neoplasias treatment, however resistance mechanism to TMZ lead to bad prognoses. In this way, the study of compounds that show cytotoxic potencial is considerably relevant to understand the disease mechanisms and to enable the study of new therapies. Guanosine (GUO) and Atorvastatin (ATOR) have already been shown modulatory potential on glutamatergic system of neurotransmission. As this system is so important to glioma development, modulating drugs may show cytotoxic potential against glioma cells. Thus we investigated: 1. ATOR cytotoxic potential to human A172 glioma cells and its effects on development glioma processes. 2. GUO cytotoxic potential to human A172 glioma cells, it effects on development glioma processes and signaling pathways involved. ATOR showed cytotoxic effect to glioma cells in similar levels to TMZ. ATOR did not show cytotoxic effect to normal astrocytes. ATOR decreased migration and proliferation of glioma cells, similarly to TMZ levels. ATOR increases apoptosis and ATOR plus TMZ potentiates this effect. ATOR also increases acid vesicular organelles, indicating induction of autophagy. Furthermore, the ionotropic and metabotropic glutamate receptors inhibition partially prevents ATOR cytotoxic effect, suggesting a possible interaction between ATOR and glutamate receptors on ATOR cytotoxic effect. GUO also showed cytotoxic effects and reduces migration similar to TMZ levels to human A172 glioma cells. GUO decreases cell proliferation of glioma cells, and this effect is abolished when GUO and TMZ are co-incubated. GUO do not change apoptosis, nonetheless GUO+TMZ show synergistic effect in increasing apoptosis. The same effect was observed on decreasing mitochondrial membrane potential and DNA damage induction. GUO does not change glutamate release. TMZ increases glutamate release and this is prevented by GUO+TMZ co-incubation. A1 or A2A adenosine receptors inhibition partially blockade GUO cytotoxic effect. The A1R and A2AR blockade reduces cell viability and the A1R inhibition and A2AR activation do not change cell viability or GUO effect. Therefore, this study contributed to unravel the ATOR and GUO antitumoral effect as well as elucidate some of the mechanism involved in this effect

Modulação do sistema glutamatérgico por cisplatina em células de glioma humano e astrócitos corticais de ratos

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013.Gliomas malignos constituem um grupo heterogêneo de tumores, com origem em precursores astrocíticos, abrangendo cerca de 70% de todos os tumores do Sistema Nervoso Central (SNC). Mesmos havendo diversos estudos relacionados e tratamentos, os prognósticos dos pacientes acometidos por esses tumores permanecem ruins. Dentre os tratamentos utilizados o quimioterápico cisplatina (CDDP) é um agente alquilante com atividade antineoplásica. Apesar do amplo espectro de atividade no tratamento de câncer, muitos mecanismos de resistência a essa droga já foram relatados. Gliomas exibem diversos mecanismos de resistência à quimioterapia, além disso, apresentam uma importante alteração no sistema glutamatérgico própria de seu desenvolvimento, que confere resistência, auxiliando na invasibilidade e agressividade tumoral. Assim, objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da CDDP sobre o sistema glutamatérgico e mecanismos de resistência em células de glioma humano A172, bem como em culturas primárias de astrócitos corticais de ratos neonatos. CDDP nas concentrações entre 500 e 1000 µM apresenta efeito citotóxico em células de glioma humano. No entanto, astrócitos corticais primários foram mais sensíveis à exposição a CDDP, aprensentando diminuição da viabilidade em menores concentrações (50 e 100 µM). CDDP 100 µM diminuiu a captação de glutamato tanto em células de glioma A172 quanto em astrócitos corticais, entretanto a CDDP 50 µM apresentou esse efeito apenas nas células de glioma A172. CDDP (50 e 100 µM) aumentou a liberação de glutamato tanto na linhagem de glioma humano quanto nos astrócitos corticais. Em se tratando de transportadores de glutamato, foram observados os níveis de expressão do EAAT-2 em células A172 tratadas com CDDP, sendo que as concentrações que alteraram o transporte não modificaram os níveis de expressão desse transportador. A implicação do trocador cistina-glutamato (sistema Xc-) no aumento da liberação de glutamato em gliomas já é bem descrita, entretanto CDDP (50 e 100 µM) não alterou seus níveis de expressão em células de glioma. CDDP não foi modificou os níveis totais de glutationa, entretanto o inibidor do sistema Xc- (sulfassalazina) causou evidente diminuição desses níveis, demonstrando a implicação da atividade do sistema Xc- nas defesas antioxidantes de células de glioma. A inibição do sistema Xc- preveniu o aumento da liberação de glutamato causado pela CDDP. E o tratamento concomitante com CDDP e sulfassalazina não alterou a viabilidade em células de glioma, sugerindo que a resistência à CDDP apresentada por estas células nas concentrações testadas, ocorre por um mecanismo diferente que a produção de glutationa. Esses resultados apontam que a CDDP pode aumentar o potencial invasivo e agressivo de células de glioma humano A172, elevando níveis extracelulares de glutamato através da modulação da atividade de transportadores glutamatérgicos