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Differential Influence of Components Resulting from Atmospheric-Pressure Plasma on Integrin Expression of Human HaCaT Keratinocytes
Adequate chronic wound healing is a major problem in medicine. A new solution might be non-thermal atmospheric-pressure plasma effectively inactivating microorganisms and influencing cells in wound healing. Plasma components as, for example, radicals can affect cells differently. HaCaT keratinocytes were treated with Dielectric Barrier Discharge plasma (DBD/air, DBD/argon), ozone or hydrogen peroxide to find the components responsible for changes in integrin expression, intracellular ROS formation or apoptosis induction. Dependent on plasma treatment time reduction of recovered cells was observed with no increase of apoptotic cells, but breakdown of mitochondrial membrane potential. DBD/air plasma increased integrins and intracellular ROS. DBD/argon caused minor changes. About 100 ppm ozone did not influence integrins. Hydrogen peroxide caused similar effects compared to DBD/air plasma. In conclusion, effects depended on working gas and exposure time to plasma. Short treatment cycles did neither change integrins nor induce apoptosis or ROS. Longer treatments changed integrins as important for influencing wound healing. Plasma effects on integrins are rather attributed to induction of other ROS than to generation of ozone. Changes of integrins by plasma may provide new solutions of improving wound healing, however, conditions are needed which allow initiating the relevant influence on integrins without being cytotoxic to cells
Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig systematische Untersuchungen zum Thema „Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen“ dargestellt. Es gelang mit Hilfe einer geeigneten kalten Atmosphärendruckplasmaquelle in Form einer dielektrisch behinderten Oberflächenentladung (DBE) ein Plasma in verschiedenen Arbeitsgasen zu zünden und Flüssigkeiten ohne direkten Plasmakontakt zu behandeln. Um einen Einblick in die komplexen Mechanismen zu bekommen, wurde im analytischen Teil dieser Arbeit das Plasma mittels OES untersucht, die angrenzende Gas-Phase mittels FT-IR-Spektroskopie und MS, und anschließend die Flüssigkeit unter Nutzung photometrischer Methoden und pH-Wert-Messungen. Auf der Basis dieser Untersuchungen folgten theoretische Ausführungen zu möglichen Wechselwirkungen der detektierten Komponenten mit der Flüssigkeit. Theoretisch entstehen bei der Luftplasmabehandlung von Wasser, über Zwischenprodukte (ROS und RNS) wie z. B. HO•, HOO•, NO•, NO2•, schlussendlich H+, NO3-, NO2- und H2O2. Bei der Argon- und Argon-Sauerstoff-Plasmabehandlung von Wasser dürften aufgrund des Stickstoffmangels nur ROS entstehen, die in der Entstehung von H+ und H2O2 enden. Diese Hypothesen zur Bildung der Spezies NO3-, NO2- und H2O2, sowie die Ansäuerung der Flüssigkeit wurden mittels photometrischer Methoden und pH-Wert-Messungen überprüft und bestätigt. Im anschließenden biologischen Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Plasmabehandlungen in den verschiedenen Arbeitsgasen auf in physiologischer NaCl-Lösung und PBS suspendierte Mikroorganismen (E. coli, S. aureus und B. atrophaeus Sporen) untersucht. In ungepuffertem Medium wurden die vegetativen Mikroorganismen innerhalb weniger Minuten Plasmabehandlung inaktiviert. In PBS hingegen wurden längere Behandlungszeiten benötigt. Das Plasma hatte auf die suspendierten Sporen wie erwartet kaum eine inaktivierende Wirkung. Die zwei vermutlichen Hauptwege laufen einerseits über reaktive Stickstoffspezies (RNS) und andererseits über reaktive Sauerstoffspezies (ROS). RNS können in Wechselwirkung mit Wasser über diverse zelltoxische Zwischenprodukte wie z. B. NO•, NO2•, N2O3, ONOOH, ONOO- zu NO3- und NO2- umgesetzt werden. ROS in Interaktion mit Wasser resultieren in Bildung von H+ und H2O2. Auch hier wird angenommen, dass eine Vielzahl an antimikrobiellen Komponenten entsteht, z. B. HO•, HOO•, O2•-. Es gibt folglich sehr viele Reaktionen und Interaktionen zwischen plasmagenerierten reaktiven Spezies und Wasser, welche in zelltoxischen Komponenten enden und die inaktivierende Wirkung des Plasmas auf suspendierte Mikroorganismen erklären. Um die Interaktionen zwischen den Phasen Plasma-Gas-Flüssigkeit besser zu verstehen und Hypothesen zu prüfen, wurden einerseits die Mikroorganismen-Suspensionen und destilliertes Wasser nur mit plasmabehandeltem Gas behandelt und andererseits die Mikroorganismen plasmabehandelter Flüssigkeit ausgesetzt. Die Untersuchungen zeigten deutlich, dass die plasmainitiierte Chemie und damit die biologischen Effekte des Plasmas auf das Gas bzw. in Flüssigkeit übertragen werden. Folglich werden biologische Effekte des Plasmas über die Gas- und Flüssigkeits-Phase vermittelt und Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen müssen immer im zusammenhängenden chemischen System Plasma-Gas-Flüssigkeit(-Zelle) betrachtet werden. Weiterhin wurden chemische und mikrobiologische Effekte durch den Einfluss von gasförmigem NO• und O3 auf Wasser bzw. suspendierte Mikroorganismen untersucht und mit der Luftplasmabehandlung verglichen. Hierbei zeigten beide Begasung deutlich geringere inaktivierende Effekte als die Luftplasmabehandlung. Die Begasung von Mikroorganismen mit NO• und O3 und die Analytik von begastem Wasser geben einen detaillierten Einblick in die Chemie und Mechanismen der RNS und ROS. Die Behandlung mit der dielektrisch behinderten Oberflächenentladung in Luft vereint diese zwei Hauptwege über RNS und ROS und resultierte somit in effektiveren antimikrobiellen Wirkungen. Durch die Experimente der vorliegenden Arbeit wurde ein geeignetes biologisches Modell gefunden und validiert, um den Einfluss von Plasma auf lebende Zellen zu untersuchen und Mechanismen von Plasmabehandlungen aufzudecken. Anhand des Modells „Mikroorganismen-Suspension“ konnte gezeigt werden, dass die Gas-Phase (Behandlungen mit DBE-Abgas) und die extrazelluläre Flüssigkeit (Behandlungen mit plasmabehandelter Flüssigkeit) eine bedeutende Rolle bei der Vermittlung der Plasmaeffekte spielen. Die Spezies aus dem Plasma gelangten über die Gas-Phase durch Diffusion/Penetration/ Interaktion in die Flüssigkeits-Phase, reagierten teilweise zu anderen reaktiven Spezies weiter und erreichten so die Zellen. Die verschiedenen analytischen Methoden und anschließende theoretische Betrachtungen der Phasen Plasma-Gas-Flüssigkeit gaben einen detaillierten Einblick in die chemischen Mechanismen von Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen und zeigten biologisch wirksame Komponenten auf.In the present work, for the first time systematic studies have been presented on the topic of "plasma-liquid-interaction". They succeeded with the help of a suitable cold atmospheric pressure plasma source in the form of a dielectric barrier surface discharge (DBD) to ignite a plasma in different working gases and to treat liquids without direct plasma contact. To get an insight into the complex mechanisms, in the analytical part of this work the plasma was investigated by OES, the adjacent gas phase by FT-IR spectroscopy and MS, and then the liquid by using photometric methods and pH measurements. On the basis of these studies followed theoretical discussion of possible interactions of the detected components with the liquid. In theory, the air plasma treatment of water results in intermediates (ROS and RNS) such as HO•, HOO•, NO•, NO2•, finally in H+, NO3-, NO2- and H2O2. In argon and argon-oxygen plasma treatment of water are likely due to the lack of nitrogen only ROS arise, which terminate in the formation of H+ and H2O2. Current hypotheses for the formation of the species NO3-, NO2- and H2O2, and the acidification of the fluid were checked and confirmed by photometric methods and pH measurements. In the biological part of the present work the influence of plasma treatments in the different working gases were investigated on in physiological NaCl solution and PBS suspended microorganisms (E. coli, S. aureus and B. atrophaeus spores). In unbuffered medium, the vegetative microorganisms were inactivated within minutes of plasma treatment. In PBS longer treatment times have been required. On the suspended spores the plasma had non inactivating effect. The two putative major routes running one hand through reactive nitrogen species (RNS) and the other on reactive oxygen species (ROS). RNS can be converted in interaction with water through various cytotoxic intermediates such as NO•, NO2• , N2O3, ONOOH and ONOO- to NO3- and NO2-. ROS in interaction with water resulted in the formation of H+ and H2O2. Also here it is assumed that a variety of antimicrobial components was produced, such as HO•, HOO•, O2•-. Consequently, there are many reactions and interactions between plasma-generated reactive species and water, which terminate in cytotoxic components and explain the inactivating effect of the plasma on suspended microorganisms. To better understand the interactions between the phases plasma, gas and liquid and to proof the hypotheses, microorganism suspensions and distilled water were treated with plasma-treated gas and exposed the microorganisms to the plasma-treated liquid. The studies clearly showed that the plasma-initiated chemical, and thus the biological effects of the plasma were transferred to the gas or in the liquid. Consequently, the biological effects of the plasma are mediated by the gas and liquid phases and plasma-liquid-interactions must always be considered as the coherent chemical system plasma-gas-liquid(-cell). Furthermore, chemical and microbiological effects were investigated by the influence of gaseous NO• and O3 on water and suspended microorganisms and compared with the air plasma treatment. Here, both fumigations showed lower inactivating effects than the air plasma treatment. The fumigations of microorganisms with NO• and O3 and the analysis of gassed water gave a detailed insight into the chemistry and mechanisms of RNS and ROS. The treatment with the surface dielectric barrier discharge in air combines these two main routes via RNS and ROS and therefore resulted in more effective anti-microbial effects. A suitable biological model was found by the experiments of the present study and validated in order to investigate the influence of plasma on living cells and reveal mechanisms of plasma treatments. The model of "microorganisms-suspension" could be shown that the gas-phase (treatments with DBE exhaust gas) and the extracellular fluid (treatments with plasma-treated liquid) play a notable role in mediating the plasma effects. The species of the plasma reached via the gas phase by diffusion / penetration / interaction the liquid phase, partially reacted further to other reactive species, and thus achieved the cells. The different analytical methods and subsequent theoretical considerations of the phases plasma, gas and liquid gave a detailed insight into the chemical mechanisms of plasma-liquid-interactions and showed biologically active components
2013b) Differential influence of components resulting from atmospheric-pressure plasma on integrin expression of human HaCaT keratinocytes
Adequate chronic wound healing is a major problem in medicine. A new solution might be non-thermal atmospheric-pressure plasma effectively inactivating microorganisms and influencing cells in wound healing. Plasma components as, for example, radicals can affect cells differently. HaCaT keratinocytes were treated with Dielectric Barrier Discharge plasma (DBD/air, DBD/argon), ozone or hydrogen peroxide to find the components responsible for changes in integrin expression, intracellular ROS formation or apoptosis induction. Dependent on plasma treatment time reduction of recovered cells was observed with no increase of apoptotic cells, but breakdown of mitochondrial membrane potential. DBD/air plasma increased integrins and intracellular ROS. DBD/argon caused minor changes. About 100 ppm ozone did not influence integrins. Hydrogen peroxide caused similar effects compared to DBD/air plasma. In conclusion, effects depended on working gas and exposure time to plasma. Short treatment cycles did neither change integrins nor induce apoptosis or ROS. Longer treatments changed integrins as important for influencing wound healing. Plasma effects on integrins are rather attributed to induction of other ROS than to generation of ozone. Changes of integrins by plasma may provide new solutions of improving wound healing, however, conditions are needed which allow initiating the relevant influence on integrins without being cytotoxic to cells